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之前小新向大家隆重介绍了一款提取植物总RNA的强效产品——高多糖多酚植物总RNA试剂盒，这款试剂盒通用性极强，几乎可以提取任何植物样本，受到了很多植物研究人员的喜爱。但是世上万物没有十全十美的，今天我们用实验自爆这款明星产品的缺陷。
实验目的：
验证Simgen高多糖多酚植物总RNA试剂盒存在的产品缺陷。
实验材料：
埃克莱尔（一种绿色月季花，由浙江农林大学友情提供）、研钵、液氮
高多糖多酚植物总RNA试剂盒（Simgen Cat.No.5103050）
超微量电子天平（DENVER INSTRUMENT，TP-213）
旋涡震荡器（越新仪器，XH-C）
超微量分光光度计（Simgen Cat.No.sim100）
电泳仪（北京六一仪器厂，DYY-6C型）
实验方法：
1 a. 称取250 mg花瓣放入研钵中，加入液氮研磨成粉末状。加入3 ml已加入β-巯基乙醇的Buffer RCT，继续研磨直至呈匀浆状，分别吸取650 μl匀浆液（按50 mg组织换算成50 μl匀浆物+600 μl裂解液计算）到4个RNase-free的1.5 ml离心管中，编号1、2、3、4，分别向1、2两管中加入1 μl RNase A；
b. 称取600 mg花瓣放入研钵中，加入液氮研磨成粉末状。加入1.8 ml已加入β-巯基乙醇的Buffer RCT，继续研磨直至呈匀浆状，分别吸取800 μl匀浆液（按200 mg组织换算成200 μl匀浆物+600 μl裂解液计算）到2个RNase-free的1.5 ml离心管中，编号5、6；
2. 加600 μl Buffer EX，用力混合均匀后离心5 min；
3. 吸取350 μl上清于洁净的1.5 ml管中，加入350 μl Buffer K混合均匀，混合液全部转移到过滤柱中离心；
4. 弃过滤柱，向滤液中加入700 μl 70％乙醇混合均匀，将混合液分两次加入核酸纯化柱中，离心弃滤液；
5. 依次加入500 μl Buffer WA和600 μl Buffer WBR洗涤；
6. 14000 rpm空离1 min去除残留乙醇；
7. 将核酸纯化柱置于洁净的RNase-free的1.5 ml离心管中，在纯化柱的膜中央加入50 μl RNase-Free Water，室温静置1 min，离心洗脱得到RNA。
实验结果：
1、在超微量分光光度计上用试剂盒的RNase-Free Water调零，测量洗脱下来的RNA，结果如下：
1、2是50 mg加了RNase A的花瓣组织提取的RNA；
3、4是50 mg花瓣组织提取的RNA；
5、6是200 mg花瓣组织提取的RNA。
2、在1%的琼脂糖凝胶上，加入5 μl洗脱的RNA进行电泳，结果如下：
分析与讨论：
1. 从样品编号3、4测得的浓度可以发现，50 mg埃克莱尔花瓣就提取到了大约17 μg的RNA，说明这种花瓣的RNA含量非常高。而同样是50 mg的花瓣，加入了1 μl RNase A的1、2测得的浓度只有个位数，相当于没有，这应该是RNA都被降解掉了。
2. 当样本量增加到200 mg时，可以发现只提取到了大约33.5 μg的RNA，只增加了大约2倍的量，并没有按照体积的增量相应地增加4倍。
3. 从电泳图可以看到，50 mg花瓣提取的RNA条带清晰完整，加了RNase A的RNA确实都降解了，完全没有看到条带。而200 mg花瓣提取的RNA则存在明显的降解情况。
综上所述，证明了Simgen高多糖多酚植物总RNA试剂盒对有RNase A使用的环境非常敏感，究其原因是裂解液Buffer RCT不像Trizol试剂一样含硫氰酸胍，不能像Trizol试剂一样有效地变性灭活RNase A。
其次，在没有RNase A污染的正常提取过程中，Buffer RCT采用的策略是在RNA分子周围形成保护层，防止其被剪切断裂。但如果样本中的RNA含量太高，Buffer RCT就不能保证在所有的RNA分子周围都形成有效的保护层，导致最后提取到的RNA出现部分降解的情况。
最后我们提醒用户使用Simgen高多糖多酚植物总RNA试剂盒时必须注意以下两点：
1. Simgen高多糖多酚植物总RNA试剂盒对RNA酶污染非常敏感，千万不要在使用RNA酶（比如提取质粒DNA）的实验室提取RNA，包括用过RNA酶的移液器也不能用作提取RNA。
2. 精确控制样本用量，切忌太随意。使用Simgen高多糖多酚植物总RNA试剂盒时，宁愿少用样本，也不要多用样本。对于嫩叶、嫩芽等RNA含量高的样本，用量应控制在100 mg以内，只有RNA含量低的样本（比如土豆，水果等）才推荐用到200 mg的组织，否则提取的RNA可能会出现降解现象。
