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新景实验室在去年时接到一些质粒提取的技术服务，其中有相当一部分是低拷贝质粒的细菌，这些细菌过夜培养后（OD600=3.2）的每毫升菌液一般只能提到2微克左右的质粒。就是说如果我们需要提取2mg的质粒，我们就需要培养1L以上的菌液来提取，但这只是在100%提取效率的理论状态下所需的量，而实际操作中是不可能达到100%地提取到所有的质粒，一般最多能得到80%-90%的提取率，我们先看一下下表数据：
1、2为3ml细菌进行质粒小提，60μl洗脱得到的质粒DNA；3、4为100ml细菌进行质粒中抽，2ml洗脱得到的质粒DNA；5、6是2ml质粒中抽的DNA溶液进行DNA浓缩，100μl洗脱得到的质粒DNA。
从上表可以看到我们用100ml菌液进行一次质粒中抽，只能得到115μg左右的高浓度质粒DNA，就是说我们要提2mg的质粒就需要培养2L左右的菌液，要进行20次左右的质粒中抽。这样不仅耗时长，而且成本高，效率低，那么怎样才能提高低拷贝质粒的提取效率呢？
小编通过查找文献发现一种可以提高低拷贝质粒拷贝数的方法，就是在细菌处于对数生长中期的时候加入氯霉素，因为氯霉素会抑制蛋白质合成，从而抑制细菌的繁殖，但是却不会抑制细菌的质粒合成，故此时细菌中的质粒仍可以复制合成。
为了验证，小编做了一些实验，首先挑取单菌落至5ml菌液中（2支），加入对应抗生素，37℃220rpm 培养2-3h，将两支菌液各全部转入300ml含相应抗生素的菌液中37℃220rpm 培养6-8h，此时细菌进入对数生长中期，然后向其中一瓶加入氯霉素至终浓度为170μg/ml，两瓶菌液37℃220rpm 继续培养12-16h左右。
然后取3ml菌液各两支以及相同干重量细菌各两支，编上编号，进行质粒DNA小提，60μl洗脱得到的质粒DNA并测OD，结果如下表：
1、2为3ml正常培养的菌液，3、4为3ml含氯霉素的菌液，5、6为5mg干重正常培养的菌体，7、8为5mg干重含氯霉素的菌体。
从上表中我们可以看出，在相同菌液量的时候，质粒DNA总量并无多大提高，而在相同菌体干重下却有很大的提高，这是因为氯霉素抑制细菌生长繁殖导致每毫升菌液中细菌少，又因为氯霉素不会抑制质粒DNA的复制合成，所以相同细菌个数下质粒DNA量提高了。
在这个实验中我们必须注意几点：
1. 细菌必须是含松弛型低拷贝质粒DNA，如果是严紧型细菌，就不能用这种方法，因为这种质粒DNA的复制是随着细菌染色体复制而复制合成的；
2. 细菌必须在细菌的对数生长中期加入氯霉素，因为过早加入时，细菌量太少，无法太多的细菌用以提取质粒DNA，而超过这个时期，细菌量过多，菌量达到饱和，部分菌体停止复制合成质粒DNA，此时加入氯霉素，效果已经不明显了；
3. 在细菌培养的操作过程中要保证无菌操作，避免杂菌污染；
好了，今天的新景实验室：分子生物百科就到这里了，希望今天的内容能对大家今后提取低拷贝质粒有所帮助，我们下期再见！！
2016年3月11日
新景生物实验室
