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对于从事分子生物学的研究的实验室来说，质粒抽提几乎是每天都用做的常规技术。最近，杭州新景生物技术部常收到来自童鞋们的各种求助，像质粒提取失败了、不是自已想要的那个质粒及提取得率低等等。
哈哈~关于这些问题，小编觉得呢，其实提取质粒并不难，基本上按照质粒提取试剂盒的说明书，小心操作，一般不会有问题。但是为什么还会有这些问题存在？因为在实验中我们应该注意一些我们经常忽略的细节。可能实验室的环境的污染，操作时的不注意都会造成我们培养细菌时染杂菌，使得在质粒的提取过程中现象出现异常，导致实验不成功。说到这里，有些童鞋可能会问：那我们染的杂菌是什么菌呢？其实大部分为真菌，也有可能是革兰氏阳性菌如金黄色葡萄球菌等。
为了让大家能能判断出所用的菌体是否染杂菌，继而能从实验现象可以判断出该原因，小编特意在本实验室里做了一个从染杂菌的细菌中提取质粒的对照模拟实验。
实验方案
编号 | 具体方案 |
1号 | 高拷贝质粒的大肠杆菌 |
2号 | |
3号 | 染杂菌的大肠杆菌 |
4号 | |
5号 | 全为杂菌（酵母菌） |
6号 |
实验步骤
根据simgen快速质粒DNA小量试剂盒的说明书的操作步骤进行实验。
实验结果
（一） Buffer II裂解不完全
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如上图所示1、2号为正常的大肠杆菌加入BufferII后溶液变粘稠的澄清液体；而部分染菌的细菌3、4号变为粘稠的浑浊液体；全为杂菌的5、6号加入之后溶液呈不粘稠的浑浊液体。
在加入Buffer II时，其中的碱性溶液能使革兰氏阴性菌的细胞壁破裂以及蛋白质变性，从而释放出质粒DNA、基因组DNA等细胞内容物。对于1、2号正常的革兰氏阴性细菌，Buffer II溶液能将其细胞壁破裂，释放出质粒DNA等细胞内容物从而溶液变为粘稠的澄清液体，而3、4号，我们可以看到它出现了粘稠的浑浊液体，这是因为Buffer II溶液能溶解正常的革兰氏阴性细菌的细胞但部分杂菌（革兰氏阳性菌、真菌）的细胞壁却不能破裂，不能被破裂的杂菌呈现浑浊状。5、6号都为杂菌，它们的细胞壁较厚，Buffer II溶液只能裂解很小部分的细胞壁使其穿孔而泄露部分核酸（主要是RNA），细胞内的基因组DNA等其他细胞内容物难以释放，所以它呈现了不粘稠的浑浊状。
（二）拷贝数降低或质粒丢失
图2
如上图所示1、2号正常细菌浓度平均在545ng/μl左右，而3、4号染杂菌的细菌浓度平均在340ng/μl左右，较1、2号正常的细菌浓度有明显的降低，这是因为杂菌不含质粒DNA，故相同细菌量时，所得的质粒DNA就减少了；而全部为杂菌的5、6号则浓度最低，平均为83ng/μl。看到这里同学们可能就有疑问了那为什么杂菌也会有浓度呢？这是因为Buffer II溶液对杂菌的细胞壁仍有腐蚀作用，但是只能溶解部分的细胞壁使其穿孔而泄露部分核酸（主要是RNA），而浓度值主要是因为有RNA残留。
在我们平时转接菌液时，很多同学或实验室人员为了方便会多次转接我们要用的菌液。其实这是个严重的不规范操作行为，会很容易造成杂菌污染，因为每次开盖转接都会存在染杂菌的风险，多次开盖会使染杂菌的风险增大，一旦染杂菌后就会对这次以及以后的实验会产生影响，即在一次次的转接时杂菌长时间在培养液中，大量传代，以至于它们在培养液中的比重加大，造成在随后的质粒抽提等的实验中影响实验结果，会产生最后所提的质粒得率降低等问题。
（三） 从电泳图的亮暗来判断
图3
如上图所示1、2号正常细菌条带亮于染杂菌的3、4号细菌，而全为杂菌的5、6号则看不到条带，因为它不含质粒。
看到这里童鞋们可能会问那怎么避免细菌培养中长杂菌呢，那就需要童鞋们在实验的过程中注意细节，保证在无菌环境下操作且用到的东西都事先灭菌；控制细菌过夜培养时间；每次接种细菌都从新鲜制备或划线的平板中挑取单菌落接种；并且在质粒抽提前仔细阅读试剂盒说明书后进行操作；注意这些细节小编相信实验一定会成功的~
好了，今天就说到这里了，小编下次继续和大家聊“质粒的那些事儿”，同时大家可以关注新景生物实验室（极简生物），定期有惊喜哦~请留意更新哦！
杭州新景生物实验室
2016年1月11日