Gelred核酸染料对电泳结果的影响

之前收到客户反馈说我们的DL2000 Ladder凝胶电泳条带分不开，小新第一时间联想到曾经也收到过类似的反馈，当时研究后发现是由于使用的核酸染料浓度过高导致了条带拖尾、分不开，还写了一篇文章——《怎样做一张漂亮的琼脂糖凝胶电泳图（续）》。于是小新就让客户减少核酸染料的用量，但结果仍是不理想。经过和客户的仔细沟通后了解到，客户使用的核酸染料是Gelred，而Simgen实验室用的核酸染料是EB（溴化乙锭）。那是不是因为Gelred和EB在使用效果上的不同所导致的差异呢？于是小新进行了以下实验测试。

一、实验目的

通过凝胶电泳，探究Gelred核酸染料对电泳结果的影响。

二、实验材料

Gelred（Biotium）

EB（溴化乙锭）（Simgen Cat.No.9026001）

DL2000 Ladder（Simgen Cat.No.MD1006）

50×TAE（Simgen Cat.No.9001500）

琼脂糖（BIOWEST REGULAR AGAROSE G-10）

电泳仪（北京六一仪器厂，DYY-6C型 ）

三、实验方法及结果

1. 按照客户的实验条件：每100 ml的琼脂糖凝胶加10 μl的Gelred制作1%凝胶进行电泳测试，结果如图一。图二为对照的EB染料的凝胶电泳（每100 ml的琼脂糖凝胶加10 μl的EB染料）。DL2000 Ladder的用量均为5 μl。

2. 将Gelred的浓度稀释10倍（图三）和100倍（图四）后，按每100 ml的琼脂糖凝胶加10 μl稀释后的Gelred制作1%的凝胶，取5 μl DL2000 Ladder进行电泳，结果如下。

3. 用泡染法进行Gelred染色，方法如下：

①　制作一块不含Gelred的1%凝胶，进行电泳。

②　将GelRed（10000×）稀释约3300倍到0.1 M NaCl溶液中，制成3×染色液。（例如将15 μl GelRed（10,000×）和5 ml 1 M NaCl加到45 ml纯水中）。

③　将凝胶小心地放入合适的容器中。缓慢加入足量的3×染色液浸没凝胶，室温浸泡30分钟进行染色，结果如图五。

四、分析与讨论

1. 由图一和图二可知，核酸染料用量为10 μl/100 ml凝胶时，DL2000 Ladder在Gelred作为核酸染料的凝胶上确实跑不开，但在EB作为染料的凝胶上带型正常。

2. 由图三和图四可知，随着Gelred的用量减少，DL2000 Ladder的条带逐渐清晰分开。

3. 由图五可知，Gelred泡染法对DL2000 Ladder条带分离没有影响。Gelred的说明书上也有说明：因为Gelred的分子量比较大，可能会影响DNA的迁移效果，如果预制胶（将Gelred加入凝胶中进行电泳的胶）的条带弥散或分离不理想，建议减少DNA用量、减少Gelred用量或者使用泡染法染色。原文如下：

4. 经过进一步的测试对比，我们还发现：用酶切产物制作的DNA Marker在含Gelred的琼脂糖凝胶上电泳更容易产生条带分不开的现象，但是用PCR扩增产物制作的同一种DNA marker在含Gelred的琼脂糖凝胶上电泳却不受影响。

最后我们理一下思路，大致可以推断出Gelred给我们电泳带来困扰的原因了：据说Gelred是用多碳链烃链接两个乙锭基团形成的大分子（合成大分子的目的是为了使乙锭基团不能进入细胞），既然一个Gelred分子中含有两个乙锭基团，那么这个Gelred分子中的两个乙锭基团分别嵌入到不同DNA分子中的概率就大大地提高了。这时候Gelred就像一个扣子，在电泳的过程中把两条DNA分子硬生生粘连成了一条DNA分子，这就是电泳模糊不清的主要原因！而一个EB分子是不可能同时嵌入到两个DNA分子中的，所以最多只能影响DNA的迁移速度（表现为DNA条带变宽，而不是变模糊）。当我们用泡染法进行Gelred染色的时候，DNA已经完成不同长度片段的分离了，这时候染料再嵌入，电泳条带自然就不会受影响了。同时，这也解释了为什么酶切产物制作的DNA Marker受Gelred影响最严重，因为酶切产物的粘性末端容易配对，一旦配对，两个乙锭基团分别嵌入到不同DNA分子中的概率又再次大大地提高了。

说了这么多，怎么感觉Gelred带来的麻烦这么多，用Gelred跑电泳不就是让我们聪明的科研脑袋交智商税么？要知道，EB到现在还只是可疑的致癌物质，毕竟到目前为止还没有任何证据证明直接接触EB能对任何动物有毒害性，因为溴化乙锭的分子量也不小，并不能通过皮肤进入细胞内。不过既然目前Gelred作为公认无毒的核酸染料已经被各个实验室所接受，那我们还是给正在使用Gelred的同学提一些建议：

1. 如果电泳条带（特别是有多种核酸条带混在一起的，比如DNA Marker、酶切产物、总RNA之类）模糊不清的，请尝试减少Gelred的用量，观察问题是否能够解决。

2. 如果还不能解决，尝试减少核酸的用量。因为核酸用量减少也能降低Gelred搭上两条核酸分子的概率。

3. 1、2方案都解决不了，尝试泡染法。

4. 干脆直接用EB制胶电泳。附带说一句，Gelred既然是用多碳链烃链接两个乙锭基团形成的，那两个乙锭基团也是有脱落风险的，所以使用Gelred时请和使用EB一样做好防护措施。

最后告诉大家一个好消息：经过Simgen技术人员耗时一个多月的研究和改进后，新版的DL2000 Ladder（PCR扩增产物制作）从去年1月份（批次20220129以后）开始升级上线了，新版DL2000 Ladder在Gelred（10 μl/100 ml凝胶）凝胶电泳中完全没有影响（图六），欢迎大家放心购买。