实测自制新冠病毒核酸检测试剂盒效果

自国家决定从2022年12月7号新冠疫情解封开始，奥密克戎毒株立刻让我们见识到了什么叫极其强悍的传染性：大概只过了一周时间，杭州的中小学就陆续出现了阳性病例，于是中小学停课；再过一周时间，周边的人已经到处在讨论某某单位已经有人阳了，吓得大家赶紧找N95口罩；然而到了12月19日，星期一上班前就接到好几个同事报告自己发烧要请假，怀疑被新冠病毒感染了----这速度，原来新冠病毒已经在你身边了！！！这真是给那些预测疫情高峰会在2023年1月份到来的专家们啪啪打脸。

幸亏我们公司在2020年参加过科技局组织的一个科研攻关项目，内容是如何提高新冠病毒核酸检测的灵敏度，所以已经有现成的新冠病毒核酸检测试剂了，那时候因为缺临床样本无法测试效果，既然现在有那么多现成的临床样本送上门来，那就实测一下我们自制的新冠病毒核酸检测试剂盒的效果吧，顺便也好区分下哪些同事该回家休息，哪些同事继续在工作岗位上坚守。

一、 实验目的

    从本单位同事采集咽拭子等样本，进行新冠病毒核酸检测。时间跨度：工作日每天一次检测，持续约2周时间。

二、 实验材料

病毒核酸样本保存液（Simgen Cat.No.4112020）

病毒核酸纯化试剂盒（Simgen Cat.No.4002050）

2× One Step Probe RT-PCR Mix（Simgen Cat.No.7406100）

新冠病毒核壳蛋白基因（F：5′- GGGGAACTTCTCCTGCTAGAAT -3′/R：5′- CAGACATTTTGCTCTCAAGCTG -3′/Pro：5′ -VIC-TTGCTGCTGCTTGACAGATT-BHQ1-3′）

咽拭子、样本采集管、1.5 ml离心管、8联排PCR管、滤芯吸头等耗材

新冠假病毒（阳性对照品，购自复百澳（苏州）生物科技有限公司）

水浴锅（上海宜昌仪器纱筛厂）

台式离心机（eppendorf Centrifuge 5415 D）

荧光定量PCR仪（ABI 7500）

三、 实验方法

1. 采样：

A 咽拭子：

取出拭子，避免接触拭子头，手拿拭子尾部将拭子头伸入口腔轻刮上颚两侧数次；将拭子头浸入病毒核酸样本保存液中，折断拭子，把拭子头留在保存液中，振荡混匀，得到拭子样本洗液，取200 μl拭子样本洗液提取病毒RNA。

B 鼻拭子：

取出拭子，避免接触拭子头，手拿拭子尾部将鼻拭子垂直地插到推不动时拧几下，充分的沾一下体液后取出来；将拭子头浸入病毒核酸样本保存液中，折断拭子，把拭子头留在保存液中，振荡混匀，得到拭子样本洗液，取200 μl拭子样本洗液提取病毒RNA。

C 唾液：

  直接收集200 μl唾液提取病毒RNA。

D 尿液：

  直接收集200 μl尿液提取病毒RNA。

E 粪便：

  用灭菌的牙签挑取约200 mg左右的粪便，加入到装有1 ml生理盐水的1.5 ml离心管中，旋涡振荡直至粪便完全分散开来。12000 rpm离心1分钟，取200 μl顶部上清液提取病毒RNA。

2. 在1.5 ml离心管中加入20 μl蛋白酶K贮存液，再加入200 μl样本。

3. 加入200 μl含Carrier RNA的Buffer VL，旋涡振荡约15秒混匀。

4. 将离心管置于56℃水浴10分钟。

5. 加入320 μl无水乙醇，温和地翻转4~6次混合均匀。

6. 吸取步骤5中的溶液加入到核酸纯化柱中（核酸纯化柱置于2 ml离心管中），盖上管盖，12000 rpm离心30秒。

7. 弃2 ml离心管中的滤液，将核酸纯化柱置回到2 ml离心管中，在核酸纯化柱中加入700 μl Buffer WBR，盖上管盖，12000 rpm离心30秒。

8. 弃2 ml离心管中的滤液，将核酸纯化柱置回到2 ml离心管中，14000 rpm离心1分钟。

9. 弃2 ml离心管，将核酸纯化柱置于一个洁净的1.5 ml离心管中，在纯化柱的膜中央加入50 μl 56℃预热的Buffer TE，盖上管盖，室温静置1分钟，12000 rpm离心30秒得到病毒RNA。

10. 按下表配制PCR反应体系

RT-PCR扩增条件：50℃ 5 min；95℃ 10 s；（95℃ 5 s；60℃ 30 s）×40 cycles

四、实验结果

五、 分析与讨论

1. 图一是第一天的测试结果（均用咽拭子采样）：其中1、3、5号同事是有发烧症状的，经单管采样检测，结果很明确是阳性，其他2、3、6号是无症状同事混管检测的结果，均为阴性。该次测试阳性对照品使用的新冠假病毒样本，后续测试的阳性对照品都用上真实的新冠病毒样本了。

2. 图二是第4天的测试结果（均用咽拭子采样）：这几天可以说是阳性大爆发阶段，2、10、13号同事虽然还没有症状，被劝在家休息，然后第二天开始陆续出现发烧症状了。所以说核酸检测灵敏度确实很高，被感染后没症状都能检测出阳性。

3. 图三是第9天的测试结果（均用咽拭子采样）：这是大部分阳过的同事感觉症状消失返岗后做的检测，但核酸检测结果大部分人仍然是阳性，只是CT值比较大（30~36左右，见表三）！

4. 图四是对一名阳过返岗的同事的不同部位采样后的检测结果，发现除了尿液样本外，各个不同采样部位的检测结果仍然是阳性。但最令人震惊的是：鼻拭子检测结果竟然是强阳性（CT值达到了22.25见表四）！

5. 经过这一轮新冠爆发采集到样本的实测，证明Simgen的病毒核酸保存液、病毒核酸纯化试剂盒、2× One Step Probe RT-PCR Mix都很靠谱，做新冠病毒核酸检测毫无压力。

需要做RNA病毒检测的同学只需要自己合成一下引物和探针，再打包购买Simgen的病毒核酸保存液、病毒核酸纯化试剂盒、2× One Step Probe RT-PCR Mix三款产品，一套DIY的病毒荧光PCR核酸检测试剂盒就大功告成了！

6. 根据图四和表四的结果，我们斗胆猜测并解释一下新冠病毒现在的传染性为什么这么强吧：当我们的感冒症状消失后，以我们阳康的一位同事为例，咽拭子测的CT值在33.89左右，唾液测的CT值是34.69（已经非常接可解除隔离的CT值35了），我们做荧光PCR做得多的同学大概都估计的出来，这也就是个位数病毒核酸分子数能测得的结果，确实传染性很低了。

但是鼻拭子的CT值是22.25！也就是说鼻拭子中病毒的浓度几乎是咽拭子病毒浓度的10000倍！看来关于“若连续2次核酸检测Ct值≥35可解除隔离”的指导意见压根就不靠谱，除非备注上“鼻拭子采样检测”才行。

我们也可以自行脑补一下，那些咽拭子采样检测后解除隔离的新冠感染康复者在人群中打了个喷嚏，再或者是擦了擦鼻涕丢个纸巾，然后……然后或许这就是解封前疫情此起彼伏，解封后迅速感染爆发的真实原因了吧？

六、感想

最后，让我们庆祝一下，折磨了我们三年的新冠病毒终于以一种突然爆发的方式从我们的生活中消失了。如果回到100年前生物学还没有发展到细胞生物学以及分子生物学领域的时候，疫情的结局估计也还是一样，只是发生在当代的这一轮疫情，经过现代文明的干扰，疫情持续的时间被硬生生地给拉长了。

所以是时候给提出“群体免疫”理论的英国科学家平反了：打败病毒的不会是隔离和核酸检测，仍然是要靠人类生命个体本身的免疫力。如果说新冠疫情带给了人类什么正面意义上的作用的话，大概就是锻炼了一把人类的免疫力吧。

当然，即便再出现一次类似的生化危机，在疫情前期我们还是要支持国家的防疫措施的，这样至少可以在病毒高致死率的阶段把病毒阻挡在国门之外，毕竟国人的生命安全还是第一位的。

但是后续等到国外病毒变异到致死率降低（烈性传染病毒在传染的过程中变异得更温和是自然选择的规律）的时候，就要及时解除费力不讨好的防疫措施了，或者干脆把防疫措施更改为老年人保护措施。毕竟，病毒就像《三体》里对蝗虫的描述一样：虫子从来就没有被真正战胜过。