实验耗材DNase、RNase、细菌内毒素的检测方法

分子生物学实验过程中会需要用到各种各样的耗材，比如离心管、移液器吸头、各类试剂瓶和冻存管等，有些实验对耗材的要求比较高，比如RNA实验中会要求耗材必须是RNase-free的，细胞转染实验中会要求耗材是无细菌内毒素的。

小新之前购买滤芯吸头的时候咨询过几个厂家，当问到吸头是否是DNase-free/RNase-free时他们都会说是的，但是当问到他们有没有检测过、是否有COA时，这几个厂家要么就直接说没有，要么就直接不说话了。这是因为很多耗材生产厂家并不具备这方面的相关知识，没有这方面的意识；也有一部分厂家虽然了解这方面的知识，也在生产过程中进行了控制，保证生产的耗材是DNase-free/RNase-free的，但是却缺少检测手段或检测条件，无法让客户信任。

正好前段时间有个耗材厂家找到我们，想让我们帮忙检测他们生产的耗材是否有DNase、RNase、细菌内毒素残留，今天小新就把检测的方法分享给大家。

一、检测材料

待测吸头、待测容器

无酶无内毒素吸头及耗材：1 ml滤芯吸头（Axygen，TF-1000-R-S），200 μl滤芯吸头（Axygen，TF-200-R-S），10 μl滤芯吸头（Axygen，TF-300-R-S），1.5 ml离心管（Axygen，MCT-150-C）

DL2000 Ladder（Simgen Cat.No.MD1006）

DNA纯化试剂盒（Simgen Cat.No.2101050）

DNase Ⅰ（Simgen Cat.No.8003050）

6×Loading Buffer（Simgen Cat.No.9008005）

ddH₂O

Carrier RNA（干粉，Simgen Cat.No.4003201）

RNase A（Simgen Cat.No.8001001）

DEPC处理ddH₂O

无内毒素水（细菌内毒素检查用水）

细菌内毒素（15 EU）

鲎试剂（快速凝胶法λ=0.25 EU/mL）

电热恒温培养箱（DNP-9082，上海精宏实验设备有限公司）

电泳仪（北京六一仪器厂，DYY-6C型）

二、检测方法

（一）DNase检测

1. 配置1%琼脂糖凝胶待用；

2. 将DL2000 Ladder用DNA纯化试剂盒清洁回收，去除DNaseⅠ消化抑制物；

3. 设置阳性对照2组，阴性对照2组，测试样本n组（在确定无酶的离心管中配制）：

阳性：8份清洁后的DL2000 Ladder+1份10×DNase Buffer +1份DNaseⅠ；

阴性：8份清洁后的DL2000 Ladder+1份10×DNase Buffer +1份ddH₂O；

测试样品：8份清洁后的DL2000 Ladder+1份10×DNase Buffer +1份ddH₂O；

4. 测试吸头类：用待测吸头吹吸步骤3中的测试样品组溶液10次混匀；

测试容器类：在待测容器里加入步骤3中的测试样品组溶液，使用配套设备（盖子、封口膜等）密封，振荡混匀15 s后静置1 min，离心1000 rpm 10 s；

5. 将3组反应液放置37℃消化1 h；

6. 加入6×Loading Buffer，电泳30 min。

（二）RNase检测

1. 用DEPC处理ddH₂O配置1%琼脂糖凝胶待用；

2. 用1.5 ml DEPC处理ddH₂O溶解干粉Carrier RNA，浓度大约206 ng/μL；

3. 设置阳性对照2组、阴性对照2组、测试样本n组（在确定无酶的离心管中配制）：

阳性：1 份RNase A+9份Carrier RNA

阴性：1 份DEPC处理ddH₂O+9份Carrier RNA

测试样品：1份DEPC处理ddH₂O+9份Carrier RNA

4. 测试吸头类：用待测吸头分别吹吸步骤3中的测试样品组溶液10次混匀；

测试容器类：在待测容器里加入步骤3中的测试样品组溶液，使用配套设备（盖子、封口膜等）密封，振荡混匀15 s后静置1 min，离心1000 rpm 10 s；

5. 将3组反应液放置37℃消化30 min；

6. 加入6×Loading Buffer，电泳15 min。

（三）内毒素检测

1. 细菌内毒素每瓶加1 ml无内毒素水溶解，振荡混匀15 min，然后用无内毒素水稀释到1 EU/ml，振荡混匀15 s备用（4℃可保存4小时）；

2. 测试吸头类：吸取适量无内毒素水于明确无内毒素的离心管中，用待测吸头吹吸10次混匀得到提取液，吸取或合并提取液至100 μl进行测试，10 min内使用；

测试容器类：容器里加入适量无内毒素水（10-100 μl，不宜过多），使用配套设备（盖子、封口膜等）密封，振荡混匀15 s后得到提取液，吸取或合并提取液至100μl进行测试；

3. 向鲎试剂安瓿瓶中加100 μl无内毒素水，轻轻振荡使鲎试剂完全溶解（注意不要产生气泡，即用即配），按下列分组进行测试：

阳性：取2支鲎试剂加入100 μl步骤1的细菌内毒素；

阴性：取1支鲎试剂加入100 μl无内毒素水；

测试样品：取n支鲎试剂加入100 μl步骤2的提取液；

4. 封口后放入恒温箱37℃静置60 min±2 min，避免振动；

5. 静置完毕后，轻轻取出鲎试剂，缓慢倒转180°，判断是否有内毒素残留。

三、结果判定

1. DNase检测电泳结果如下：

若如图一所示，阴性对照及检测样品DNA条带清晰，亮度相同，阳性对照无DNA条带，则说明检测的样品是DNase-free的。

2. RNase检测电泳结果如下：

若如图二所示，阴性对照及检测样品RNA条带清晰，亮度相同；阳性对照无RNA条带，则说明检测的样品是RNase-free的。

3. 内毒素检测结果如下：

+：内容物呈坚实凝胶，不变形不从管壁滑脱；

-：不呈凝胶或虽生成凝胶但不能保持完整并从管壁滑脱。

若阳性为“+”，阴性和检测样品为“-”，则说明检测的样品无内毒素或内毒素低于检出下限。

如果小伙伴们在实验过程中出现问题，怀疑是使用耗材所导致的，可以参考小新的方法对耗材进行检测，或者直接从有检测报告或者COA的厂家采购耗材。