如何从软骨中提取DNA

软骨作为硫酸软骨素的生产原料，其来源也是生产厂家和消费者关心的重点。软骨中有多少DNA？能不能提出来？如何鉴定其来源？请看下面的实验。

实验材料：干燥的猪鼻骨

实验试剂：动物组织DNA试剂盒（simgen，Cat.No.3101050）、Buffer SP、猪源DNA基因检测试剂盒（simgen，Cat.No.7804050）

实验设备：水浴锅、高速离心机、移液器、微量紫外分光光度计及荧光PCR仪

实验方法：

1) 用全新的手术刀刮去软骨有霉变的表层，用刀尖切取中间部分，装到1.5 ml离心管（每管15-25 mg左右）中；

2) 向样本中加入20μl蛋白酶K贮存液，180μl 的Buffer AT和15μl的Buffer SP。

3) 56℃水浴至软骨完全溶解（约30 min），溶液呈透明状；

4) 加入200μl Buffer SL，旋涡震荡15 s混匀，70℃水浴10 min；

5) 加入200μl无水乙醇，温和翻转离心管4-6次，低速离心将管盖上的液体离下来。

6) 将上一步骤的液体转移到核酸纯化柱，12000 rpm离心30 s；

7) 加入Buffer WA和Buffer WB各洗涤一次；

8) 13000 rpm空离2 min；

9) 加入80μl Buffer TE洗脱DNA；

10) 在紫外分光光度计上测量DNA的浓度；

11) 琼脂糖凝胶电泳；

12) 使用4μl DNA模板进行荧光定量PCR猪源检测。

实验结果：

1．在微量紫外分光光度计上用Buffer TE调零，测量洗脱下来的软骨DNA浓度，结果如下，

2．在1%的琼脂糖凝胶上，加入8μl软骨DNA，电泳15min，结果如下，从测量的OD值来看，样品浓度很高，从25mg的软骨中可以提到8μg的DNA，OD₂₆₀/OD₂₈₀在1.75-1.78之间，DNA纯度很高，估计是因为干燥后的软骨经一段时间的保藏和运输，其中的RNA早已被降解完全。不过放了这么久，DNA可能也会有很大程度的降解，降解的短核苷酸链也会有提高OD₂₆₀吸收值的作用，所以我们来跑电泳看一下有没有基因组DNA的主条带。

出乎我们的意料，虽然可以看到部分拖尾的降解条带，但是电泳主条带也非常清晰。说明我们从软骨样本中提到了完整度很高的基因组DNA，并且含量也不低。至于为什么能从软骨中提到这么完整的DNA，推测有可能是因为软骨经干燥以后，各种酶相继失活，DNA反而得到了很好的保存。

3．荧光定量PCR猪源检测结果

阳性对照为猪源DNA基因检测试剂盒（simgen，Cat.No.7804050）中的强阳性标准品，浓度为100 ng/μl，对比荧光曲线和Ct值，我们提取的软骨DNA猪源阳性很强，Ct值相差很小，说明此软骨确实是猪来源。

通过这个实验，我们可以得出以下结论：

1. 软骨中的DNA含量比较高，可以作为鉴定样本提取DNA。

2. Simgen 动物组织DNA试剂盒能高效地提取到软骨中的基因组DNA。

3. 干燥的软骨中提取到的DNA的完整度很高，所以推测从风干的人或动物尸体中的软骨组织中取样提取DNA也是不错的选择。

                                                                                                                                                            Simgen实验室