从火龙果中提取RNA

实验目的：

从火龙果果肉中提取RNA。

实验材料：新鲜的火龙果、研钵、植物果肉总RNA试剂盒（Simgen，Cat.No.5102050）、植物总RNA提取试剂盒（Simgen，Cat.No.5101050）。

实验方法：

本次实验尝试用Simgen的植物果肉总RNA试剂盒和植物总RNA提取试剂盒两种方法来提取RNA。

植物果肉总RNA试剂盒提取步骤：

1. 用1.5 ml 离心管称取500 mg火龙果果肉，加入200 μl 已加入β-巯基乙醇的Buffer RLP，研磨棒研磨至组织完全溶解，再补加300 μl 已加入β-巯基乙醇的Buffer RLP，使最终加入Buffer RLP的总体积为500 μl。混匀后13000 rpm 离心2分钟；

*由于火龙果果肉容易破碎，本实验采用研磨棒磨碎果肉。

3. 吸取≤ 700 μl的离心上清到过滤柱中，离心取滤液；

4．向滤液中加入700 μl 70％乙醇，混匀后取700 μl混合液加入到核酸纯化柱中，离心去滤液；

5. 将剩余的混合液加入到核酸纯化柱中，再次离心弃滤液；

6. 依次用500 μl Buffer WA和600 μl Buffer WBR过柱洗涤；

7. 最高速离心，去除纯化柱上残留的乙醇；

8. 将核酸纯化柱置于一个洁净的RNase-free的1.5 ml离心管中，用50 μl RNase-Free Water洗脱RNA；

9. 在微量紫外分光光度计上测量RNA的浓度；

10. 琼脂糖凝胶电泳。

植物总RNA提取试剂盒提取步骤：

1. 离心管称取100 mg火龙果果肉，加入100 μl 已加入β-巯基乙醇的Buffer RLC，研磨棒研磨至组织完全溶解，，再补加500 μl 已加入β-巯基乙醇的Buffer RLC，使最终加入Buffer RLC的总体积为600 μl。 

*由于火龙果果肉容易破碎，本实验采用研磨棒磨碎果肉。

2. 将组织的溶解物全部转移到过滤柱中，离心取滤液；

3. 向滤液中加入600 μl 70％乙醇，混合后取600 μl混合液加入到核酸纯化柱中，离心弃滤液；

4. 将剩余的混合液加入到核酸纯化柱中，再次离心弃滤液；

5. 依次用500 μl Buffer WA和600 μl Buffer WBR过柱洗涤；

6. 最高速离心，去除纯化柱上残留的乙醇；

7. 将核酸纯化柱置于一个洁净的RNase-free的1.5 ml离心管中，用50 μl RNase-Free Water洗脱RNA；

8. 在微量紫外分光光度计上测量RNA的浓度；

9. 琼脂糖凝胶电泳。

实验结果：

1. 在微量紫外分光光度计上用RNase-Free Water调零，测量洗脱下来的RNA，结果如下：

1、2是用植物果肉总RNA试剂盒纯化获得的总RNA；3、4是用植物总RNA提取试剂盒纯化获得的总RNA。

2. 在1%的琼脂糖凝胶上，加入5 μl提取到的RNA，电泳20 min，结果如下：

讨论与分析：

1．从结果上分析用Simgen的植物果肉总RNA试剂盒和Simgen植物总RNA提取试剂盒都能提取到火龙果果肉的RNA。

2．用Simgen植物果肉总RNA试剂盒能够提取的样本量是植物总RNA提取试剂盒的5倍，因此提取到的RNA浓度更高。

    植物RNA的提取过程经常是Trizol试剂使用者的噩梦，究其原因，无一例外是因为植物组织中多糖（特别是淀粉类物质）衍生物的干扰：因为Trizol试剂中所含的硫氰酸胍遇到多糖类物质便凝结成胶冻状，阻止了RNA的进一步释放。当植物组织含有大量水分（比如果肉）时，就是多糖加RNA含量低的双重阻挠了——这时候选用Simgen果肉总RNA试剂盒提取RNA确实是省时省力的好办法。

                                                                                                                                                                                                                                                                                                                         Simgen实验室