精品肝素钠的物种源性鉴定及核酸定量方法

做PCR实验的同学们都知道，肝素钠本身是一种PCR的强烈抑制剂，这也是为什么用作DNA提取的血样都不推荐用肝素抗凝采血管采样的原因。但是如果一定要从肝素钠中提取DNA再做PCR检测，传统的酚氯仿抽提加醇沉淀DNA的提取方法肯定只能放弃了，因为肝素的结构类似多糖，只要是多糖（DNA和脱氧核糖核酸，也有多糖的特性）溶液，加醇后多糖就会沉淀下来。但是反过来说肝素钠这一多糖特性的好处就是：肝素钠在提纯的过程中肯定会残留较多的DNA，为肝素钠的物种来源鉴定提供了最直接的证据。

最近我们接到一个肝素钠物种源性鉴定的需求，收到样品后才发现这次的肝素钠并不是常见的那种黑色的粗品肝素钠，而是白色粉末状的精品肝素钠，这就意味着这个样品经过了多次深度加工处理，估计其中含有的DNA不仅数量少，而且很可能降解得非常严重了，能不能提取到足够的DNA用作物种源性检测呢？面对这一棘手样本，我们拭目以待。

实验目的：

从精品肝素钠中提取出DNA，用荧光PCR法鉴定物种源性，并估算DNA含量。 

实验材料：

两个精品肝素钠样本，来自杭州**基因工程有限公司：肝素钠（批号：DHS201023 (IL)）；依诺肝素钠（批号202004）

肝素钠DNA纯化试剂盒（Simgen Cat.No.7902050）

猪源性DNA荧光PCR检测试剂盒（Simgen Cat.No.7804050）

超微量电子天平（DENVER INSTRUMENT，TP-213）

旋涡震荡器（越新仪器，XH-C）

台式离心机（eppendorf Centrifuge 5415 D）

荧光定量PCR仪（ABI 7500）

实验方法：

1. 称取约200 mg肝素钠，加入4倍体积（800 μl）的Buffer S，旋涡震荡直至全部溶解。

2. 在一个洁净的1.5 ml离心管中加入500 μl Buffer P5和5 μl Carrier RNA，再加入100 μl步骤1中的肝素钠溶液，旋涡震荡混合均匀。

3. 将混合液转移到核酸吸附柱中，离心去滤液。

4. 在核酸吸附柱中加入700 μl Buffer WB，离心去滤液。

5. 最高速（≥12000 rpm）离心1分钟，弃2 ml离心管。

6. 将核酸吸附柱置于一个洁净的1.5 ml离心管中，在吸附柱的膜中央加入100 μl Buffer S，盖上管盖，室温静置1分钟，离心洗脱DNA。

7. 弃吸附柱，在洗脱的DNA中再次加入500 μl Buffer P5，用移液器吸注数次混匀Buffer P5和DNA溶液。

8. 将混合液转移到核酸纯化柱中，离心弃滤液。

9. 在核酸纯化柱中加入700 μl Buffer WB，离心去滤液。

10. 重复Buffer WB洗涤一次。

11. 最高速（≥12000 rpm）离心1分钟，弃2 ml离心管。

12. 将核酸纯化柱置于一个洁净的1.5 ml离心管中，在纯化柱的膜中央加入50 μl Buffer TE，盖上管盖，室温静置1分钟，离心洗脱DNA。

13. 按照猪源性DNA荧光PCR检测试剂盒说明书配置猪源检测PCR反应液，加入5 μl提取的DNA和阳性对照，进行荧光PCR检测。

实验结果：

荧光定量PCR扩增曲线如下：

1-6是阳性对照扩增结果，所含的猪源DNA量依次是5 ng、0.5 ng、0.05 ng、5 pg、0.5 pg、0.05 pg。

7、8是从肝素钠中提取的DNA的扩增结果。

9、10是从依诺肝素钠中提取的DNA的扩增结果。

分析与讨论：

1. 从荧光PCR扩增结果分析，提取的两种肝素钠样本的DNA扩增均有起线，证明两种肝素钠样本中都含有猪源DNA成分。同时也说明Simgen设计的肝素钠DNA纯化试剂盒去除肝素钠的效果挺好，没有抑制PCR扩增。

2. 从扩增曲线上分析，5 μl肝素钠提取的DNA含量与5 pg的阳性对照接近重合，5 μl依诺肝素钠提取的DNA含量在5 pg和0.5 pg的阳性对照之间。

3. 按核酸回收率100%计算，每20 mg (100 μl 20%肝素钠溶液)中含猪源DNA为50 pg，即每mg肝素钠约含猪源DNA 2.5 pg，每mg依诺肝素钠约含猪源DNA 0.625 pg。这个数量级的DNA含量已经属于痕量级的DNA了，如果在提取DNA的过程中未添加Carrier RNA的话，可能回收不到足够的DNA，也会使PCR扩增失败。

需要说明的是，PCR能扩增的DNA片段须大于100 bp，如果肝素钠在精制的过程中会降解DNA，就有可能导致样本中残留的一些DNA片段小于100 bp，而这些小片段的DNA则不能作为PCR模板进行有效的扩增。因此以荧光PCR方法对精制的肝素钠样品中的DNA含量定量分析应该不会太精确，确切地说，只能估算片段大于100 bp的DNA分子数量，其他更小片段的DNA分子则因为扩增失败而被忽略了。