不同病毒核酸样本保存液的效果差异

一、实验目的

测试不同病毒核酸样本保存液保存病毒RNA的效果。

二、实验材料

1. 病毒核酸样本保存液（Simgen Cat.No.4112100）

2. 市场上常见的含胍盐的病毒核酸样本保存液（新景生物研发）

3. 外购对照病毒核酸样本保存液（取自华越核酸检测采样管，扬州华越科技发展有限公司生产，苏扬械备20150248号）

4. 生理盐水（Simgen Cat.No.9005500）

5. 新冠假病毒（10⁸ copies/ml）（订单编号：F1518870，复百澳（苏州）生物科技有限公司）

6. 新鲜采集的人唾液

7. 病毒核酸纯化试剂盒（Simgen Cat.No. 4002050）（产品批号：20211203）

8. 2×One Step Probe RT-PCR Mix（Simgen Cat.No.7406100）（产品批号：20211240）

9. 新冠病毒特异性引物及探针（F：CCCTGTGGGTTTTACACTTAA/R：ACGATTGTGCATCAGCTGA，Probe：5’-FAM-CCGTCTGCGGTATGTGGAAAGGTTATGG-BHQ1-3’）

10. 电热恒温培养箱（上海精宏实验设备有限公司，DNP-9082）

11. 旋涡振荡器（越新仪器，XH-C）

12. 台式离心机（eppendorf Centrifuge 5415 D）

13. 荧光PCR仪（ABI 7500）

三、实验方法

1. 用唾液将假病毒（10⁸ copies/ml）稀释到10⁶ copies/ml；

2. 将三种病毒核酸样本保存液及生理盐水与唾液（含假病毒）按5:1的体积比（1.5ml + 0.3 ml）混合均匀，分别放在37℃和﹣80℃保存；

3. 保存第3天和保存第7天用病毒核酸纯化试剂盒提取四种保存液保存的假病毒RNA，提取方法如下：

1) 在1.5 ml离心管中加入20 μl蛋白酶K贮存液，再加入200 μl样本（保存液与唾液样本的混合物）。

2) 加入200 μl含Carrier RNA的Buffer VL，旋涡振荡约15秒混匀。

3) 将离心管置于56℃水浴10分钟。

4) 加入320 μl无水乙醇，温和地翻转4~6次混合均匀。

5) 吸取步骤4）中的溶液加入到核酸纯化柱中（核酸纯化柱置于2 ml离心管中），盖上管盖，12000 rpm离心30秒。

6) 弃2 ml离心管中的滤液，将核酸纯化柱置回到2 ml离心管中，在核酸纯化柱中加入700 μl Buffer WBR，盖上管盖，12000 rpm离心30秒。

7) 弃2 ml离心管中的滤液，将核酸纯化柱置回到2 ml离心管中，13200 rpm离心2分钟。

8) 弃2 ml离心管，将核酸纯化柱置于一个洁净的1.5 ml离心管中，在纯化柱的膜中央加入50 μl 56℃预热的Buffer TE，盖上管盖，室温静置1分钟，12000 rpm离心30秒得到病毒RNA。

用2×One Step Probe RT-PCR Mix扩增提取到的病毒RNA，扩增体系如下

实验参数：50℃ 5 min；95℃ 1 min；（95℃ 10s；60℃ 30s）×40 cycles

四、实验结果

图1：第3天扩增曲线图

表1：第3天扩增结果CT值

图2：第7天扩增曲线图

表2：第7天扩增结果CT值

五、分析与讨论

1. 根据扩增曲线图1、图2及CT值（表1、表2）分析，除了生理盐水外，其余三种保存液在第三天与第七天时37℃保存和﹣80℃保存结果相似，CT值差异较小。

2. 根据扩增曲线图1、图2及CT值（表1、表2）分析，37℃存放7天后，新景病毒核酸样本保存液（平均CT值25.32）对比含胍盐的保存液（平均CT值26.10）平均小约0.78个CT值；比生理盐水（平均CT值27.45）平均小2.13个CT值；对比外购的华越科技的病毒核酸样本保存液（平均CT值35.18）平均小9.86个CT值。
综上可以推测出，与新景病毒核酸样本保存液保存的新冠假病毒对比，生理盐水保存的新冠假病毒在37℃存放7天后约有80%的假病毒RNA被水解；华越科技的病毒核酸样本保存液保存的新冠假病毒在37℃存放7天后则有99.9%以上假病毒RNA已经被水解。

3. 根据图1及表1还可以推测出，在新冠假病毒和病毒样本保存液混合后，如果病毒样本保存液中不含灭活RNA酶的蛋白变性剂（比如市场上与生理盐水同类的非灭活型病毒保存液）的，病毒RNA降解非常迅速，在放入﹣80℃冻存前（操作时间约20分钟）已经大量水解。

4. 根据表2的数据可以得出结论，新景生物的病毒核酸样本保存液与假病毒混合后在37℃存放7天的样本（平均CT值25.32），与同步在﹣80℃保存的样本（平均CT值24.8）对比CT值变化不大，较市场上常见的含胍盐保存液（灭活型）（平均CT值26.10）保存病毒RNA的稳定性更高，配套应用于RNA病毒检测的取样环节能有效提高检测的灵敏度。

5. 外购的华越科技的病毒核酸样本保存液较生理盐水保存病毒的效果更差，并且在与假病毒混合后即开始降解病毒RNA，说明该病毒核酸样本保存液含溶解病毒颗粒的试剂组分，但缺少稳定RNA的试剂组分，不能用于病毒RNA样本的保存。