OD260-------核酸浓度的唯一标准？？

前几日，小编拿出之前提取的DNA想要做实验，测浓度时发现其OD₂₆₀值比之前测得的数值明显升高，严谨的小编果断拿着样本去跑了电泳，结果发现电泳条带拖尾明显。我们都知道，电泳条带拖尾无非两个原因：一是目的DNA降解拖尾；二是RNA的降解拖尾。小编手中的DNA样本是试剂盒提取的质粒DNA，所以我们几乎可以确定造成这个现象的原因是DNA出现了降解。

OD₂₆₀吸收值增加和DNA降解有什么必然的联系吗？随即小编又用DNA纯化试剂盒（Simgen Cat. No. 2101050）把这可能是降解的DNA样本重新进行纯化，重测样本的OD₂₆₀值明显变小了（不是通常的变小10%左右，而是变小了30%以上）。小编忍不住开始猜想：很有可能是降解的小片段DNA在起作用，因为DNA纯化试剂盒不能有效地回收小于100 bp的DNA片段。于是小编迫不及待地设计了一个简单的实验：

样本：新鲜提取的细菌基因组DNA

设备：水浴锅、恒温培养箱、微量紫外分光光度计(simgen)、移液器等。

实验内容：将样本按50μl/支分装在1.5ml离心管中，盖上管盖，分别放置在-20℃冰箱、37℃恒温箱以及56℃水浴锅中，每隔相同的时间用紫外分光度计测定它们的浓度、并记录，最后进行电泳。实验结果如表一：

表一：相同初始浓度DNA在不同温度下温育后的浓度

电泳图谱如下：

1号为-20℃保存5h

2号为37℃温育5h

3号为56℃温育5h

1.0%TAE凝胶电泳20min

从上图可以看出，1号和2号亮度差别不明显，3号最暗，但是由表一可得56℃温育后的DNA浓度最高。理论上56℃温育后的浓度最高，那么电泳条带也应该最亮，但是为什么测得的浓度和电泳图却对不上呢？我们猜想：这是因为DNA降解后，长的基因组DNA变少导致的，但是3号的拖尾带也并未变亮，可能是因为在高温下时间过长而导致DNA被降解成极短片段的核酸甚至单核苷酸，所以其荧光产率也相对较低而导致拖尾变暗。

为了验证以上猜想，小编立马查找相关文献，并获得了极有价值的以下内容：

表二：不同核酸260 nm处1 OD吸光值的浓度

小编最后还特意拿了PCR引物（小片段单链核酸）及dNTPs（单核苷酸）测OD₂₆₀值，发现还真有吸收值，并且非常高。这似乎充分说明了为什么DNA放置过长时间或反复冻融后浓度变高的原因：DNA降解导致OD₂₆₀值变大。推而广之，既然小片段核酸、单链核酸对OD₂₆₀值都有很大的贡献，那么PCR产物、降解DNA及酶切产物等就都不能单纯的用测OD值的方法来估算其浓度了，因为它们或多或少都含有其他小片段DNA。

看来光凭OD₂₆₀的吸收值的方法来判定核酸浓度并不可靠，因为紫外分光光度计测出的值包含了所有长度和类型的核酸，即包括降解的短片段核酸、单链核酸及RNA等，想准确判断核酸浓度应该以紫外分光光度计测值和电泳相结合进行分析。