未知物种尾部组织的鼠源性鉴定

一、材料：

1. 样品：送检尾部组织样本由客户提供。

2. 动物组织DNA试剂盒（Simgen，Cat.No.3101050）

3. PCR扩增试剂、引物、探针为杭州新景生物试剂开发有限公司自配或委托上海生工生物技术有限公司合成。

4. PCR仪：ABI PRISM® 7500 Sequence DeteCtion System

5. 离心机：Thermo Biofuge pico

二、方法：

1. 用Simgen动物组织DNA试剂盒分离纯化样本中的DNA。

2. 按下列组分配制PCR检测试剂( 40 μl反应体系)：

Master Mix(2×)              20.0 μl

上游引物FP                1.0 μl

下游引物RP                1.0 μl

探针Probe                  0.5 μl

50× ROX                   0.8μl

ddH₂O                     11.7 μl

向每个PCR反应管中加入35 μl反应混合液，再加入5μl分离纯化的DNA进行qPCR检测。

注：阳性对照用实验室保藏的小鼠肌肉DNA作为模板，阴性对照用ddH₂O作为模板。

3. PCR循环条件设置： 95℃ 1 min→40×（95℃ 15s→60℃ 30s）

三、结果判定：

1．有效性原则

阴性对照：无FAM荧光信号检出，未出现典型的扩增曲线。

阳性对照：有FAM荧光信号检出，并出现典型的扩增曲线。

以上要求必须同时满足，否则本次检测无效。

结果：

1. 送检样本中的尾部组织DNA通过鼠的特异性荧光探针扩增检测呈阳性，判断样本的物种为鼠。

2. 结果分析：

1） 本次尾部组织样本提取了两管DNA，编号为Sample 1和Sample 2，经PCR扩增均为阳性，Ct值分别为16.105和16.524，阳性对照的Ct值分别为16.358和16.596，阴性对照未起线。

2） 从样本DNA电泳发现，样本的DNA保存较为完整，应该是尾部组织水分少，腐败情况不严重。

 送检动物尾部组织样本的Ct值报告：

送检动物尾部组织样本的荧光定量PCR扩增曲线：

送检动物尾部组织样本DNA电泳图：

如图所示，其中M为DL2000Marker, 泳道1、2为送检样本DNA，泳道3、4是实验室保藏的小鼠肌肉组织DNA。