一、材料:
1. 样品:
由厦门**商贸有限公司提供。
2. 动物组织DNA试剂盒(Simgen,Cat.No.3101050)
4. PCR扩增试剂、引物、探针为杭州新景生物试剂开发有限公司自配或委托上海**生物技术有限公司合成。
5. PCR仪:ABI PRISM® 7000 Sequence DeteCtion System
6. 离心机:Thermo Biofuge pico
二、方法:
1. 用Simgen动物组织DNA试剂盒分离纯化白鱼粉中的DNA。
2. 按下列组分配制PCR检测试剂( 40 μl反应体系):
Master Mix(2×) 20.0 μl
上游引物FP 1.0 μl
下游引物RP 1.0 μl
探针Probe 0.5 μl
50× ROX 0.8μl
ddH2O 11.7 μl
向每个PCR反应管中加入35 μl反应混合液,再加入5μl分离纯化的DNA进行RT-PCR检测。
注:阳性对照用鸡DNA作为模板,阴性对照用ddH2O作为模板。
3. PCR循环条件设置: 95℃ 1min→40×(95℃ 15s→60℃ 30s)
三、结果判定:
1.有效性原则
阴性对照:无FAM荧光信号检出,未出现典型的扩增曲线。
阳性对照:有FAM荧光信号检出,并出现典型的扩增曲线。
结果:
1. 送检的样品未检测到鸡源DNA组分。
2. 结果分析:
① 送检样品和阴性对照均未起线,阳性对照CT值为19.55。
② 注意:本基因检测仅能检测到鸡源DNA组分,不能检测到其他鸟类的DNA组分,即样品中若含有鸭、鹅等DNA组分,也是无法检测出的。
Ct值报告截图如下:
荧光定量PCR扩增曲线截图如下: