未知干粉和斜面培养菌中检测目的菌种

一、实验目的：

检测3包干粉和4管斜面培养菌中是否含有目的菌种。

二、实验材料及设备：

1.样品：送检的3包干粉样本，4管斜面培养菌，已标注1~7号，由客户提供。

2.全血/培养细胞DNA试剂盒（simgen，Cat.No.3002050）。

3.2×PCR Mix（simgen，Cat.No.7003100），DL 2000 DNA Marker，目的菌种特异性引物（BC-F：5-TACGGCATTGGCAAGTATCA-3；BC-R：5-CGACATGATTTGGTTTTCCA-3）（BS-F：5-CAGGCTCACACTTTGTCTTG-3；BS-R：5-TGAACACAGTCCTGGGTTAG-3）为客户提供。

4. PCR仪：Techne FPROGO5Y Progene Thermal.

5.离心机：Thermo Biofuge pico.

6.无菌超净工作台、气浴恒温振荡器、微量紫外分光光度计、电泳仪。

三、实验方法：

（一）菌液收集

1. 在无菌超净台中取3个灭菌处理过的50ml离心管，倒入15ml灭菌处理过的ddH₂O。

2. 将干粉倒入离心管中，盖好管盖，标记序号4、5、6。

3. 将离心管漩涡振荡混匀，静置半小时。

4. 用1.5 ml离心管收集3ml静置上清液，标记序号4、5、6。

5. 向斜面培养基中加入6ml灭菌处理过的ddH₂O，用移液枪吹打使菌悬浮。

6. 用1.5 ml离心管收集3ml悬浮液，标记1、2、3、7。

（二）菌液DNA提取：

1. 向1~7号1.5 ml离心管加入100 μl Buffer TE，旋涡振荡充分悬浮。加入100 μl溶菌酶溶液，旋涡振荡约15秒混匀，37 ℃水浴30分钟。

2. 加入20 μl蛋白酶K贮存液，加入200 μl Buffer SL，旋涡振荡约15秒混匀。将离心管置于56 ℃水浴10分钟。

3. 12000 rpm离心1分钟，取400 μl上清液转移到新的1.5 ml离心管中。

*本步骤是额外增加的，为了除去菌液中混有的不溶物质。

*若上清液不足400 μl也无妨，小心不要吸入沉淀。

4. 加入200 μl无水乙醇，旋涡振荡约15秒混匀。

5. 吸取步骤4中的溶液加入到核酸纯化柱（纯化柱置于2 ml离心管中）中，盖上管盖，12000 rpm离心30秒。

6. 弃2 ml离心管中的滤液，将核酸纯化柱置回到2 ml离心管中，在核酸纯化柱中加入500μl Buffer WA, 盖上管盖，12000 rpm离心30秒。

7. 弃2 ml离心管中的滤液，将核酸纯化柱置回到2 ml离心管中，在核酸纯化柱中加入600 μl Buffer WB, 盖上管盖，12000 rpm离心30秒。

8. 弃2 ml离心管中的滤液，将核酸纯化柱置回到2 ml离心管中，盖上管盖，14000 rpm离心1分钟。

9. 弃2 ml离心管，将核酸纯化柱置于一个洁净的1.5 ml离心管中，在纯化柱的膜中央加入80 μl 56℃温育的Buffer TE，盖上管盖，室温静置1分钟，12000 rpm离心30秒。

10. 弃纯化柱，洗脱的DNA在微量紫外分光光度计上测量浓度。

（三）PCR扩增

1.用ddH₂O将引物稀释到10μM。

2.按下表配制PCR扩增体系：

按9管的量配制混合液，并以每管35 μl分至8个离心管（PCR反应管）中。

* 其中有一管是阴性对照组。

3.向其中一管PCR反应体系的混合液中加入5 μl ddH₂O 作为阴性对照组，剩余的加入5μl 提取的DNA，标好序号，充分混匀，简短离心以收集残留在管壁的液体。

4.进行PCR扩增，反应参数如下：

三、实验结果：

1.在微量紫外分光光度计上用Buffer TE调零，测量洗脱下来的DNA，结果如下：

2.配制2%的琼脂糖凝胶，依次加入5 μl DL 2000 DNA Marker、5 μl待检样本DNA扩增产物和阴性对照，接通电源，电泳30分钟，结果如下：

       图一（BC引物）                  图二（BS引物）

M：DL 2000 DNA Marker  

1~7:1~7号待检测菌   

8：阴性对照

四、实验结论：

1. BC引物扩增的特异性条带为555bp，图一中，1,2,3号出现明显的目的条带，而7号虽然也有条带出现，但长度在1000bp以上，并不是目的条带，而其他样本并未扩增出条带，所以1,2,3号样本中含有凝结芽孢杆菌，4,5,6,7号样本中不含凝结芽孢杆菌。

2. BS引物扩增的特异性条带为1287bp，图二中只有6,7号样本扩增出目的条带，其余样本均为出现条带，所以6,7号样本中含有枯草芽孢杆菌，1,2,3,4,5号样本中不含枯草芽孢杆菌。