未知干粉中检测目的菌种

一、实验目的：

检测3包未知干粉中是否含有目的菌种。

二、实验材料及设备：

1.样品：送检的3包干粉样本，由客户提供。

2.全血/培养细胞DNA试剂盒（simgen，Cat.No.3002050）。

3. 2×PCR Mix（simgen，Cat.No.7003100），DL 2000 DNA Marker，目的菌种特异性引物（BC-F：5-TACGGCATTGGCAAGTATCA-3；BC-R：5-CGACATGATTTGGTTTTCCA-3）为客户提供。

4.  PCR仪：Techne FPROGO5Y Progene Thermal.

5.离心机：Thermo Biofuge pico.

6.无菌超净工作台、气浴恒温振荡器、微量紫外分光光度计、电泳仪。

三、实验方法：

（一）菌液培养

1. 在无菌超净台中取3个灭菌处理过的50ml离心管，倒入10ml灭菌处理过的肉汤培养液。

2. 将干粉倒入离心管中，盖好管盖，标记序号1（2017.12.13）、2（2017.12.21）、3（2018.01.20）。

3. 将离心管放入气浴恒温振荡器中，37 ℃、220 rpm培养12小时。

4. 静置2小时。

（二）菌液DNA提取：

1. 用1.5 ml离心管收集3 ml静置上清液，编号1、2、3，加入100 μl Buffer TE，旋涡振荡充分悬浮。加入100 μl溶菌酶溶液，旋涡振荡约15秒混匀，37 ℃水浴30分钟。

2. 加入20 μl蛋白酶K贮存液，加入200 μl Buffer SL，旋涡振荡约15秒混匀。将离心管置于56 ℃水浴10分钟。

3. 12000 rpm离心1分钟，取400 μl上清液转移到新的1.5 ml离心管中。

*本步骤是额外增加的，为了除去菌液中混有的不溶物质。

*若上清液不足400 μl也无妨，小心不要吸入沉淀。

4. 加入200 μl无水乙醇，旋涡振荡约15秒混匀。

5. 吸取步骤4中的溶液加入到核酸纯化柱（纯化柱置于2 ml离心管中）中，盖上管盖，12000 rpm离心30秒。

6. 弃2 ml离心管中的滤液，将核酸纯化柱置回到2 ml离心管中，在核酸纯化柱中加入500μl Buffer WA, 盖上管盖，12000 rpm离心30秒。

7. 弃2 ml离心管中的滤液，将核酸纯化柱置回到2 ml离心管中，在核酸纯化柱中加入600 μl Buffer WB, 盖上管盖，12000 rpm离心30秒。

8. 弃2 ml离心管中的滤液，将核酸纯化柱置回到2 ml离心管中，盖上管盖，14000 rpm离心1分钟。

9. 弃2 ml离心管，将核酸纯化柱置于一个洁净的1.5 ml离心管中，在纯化柱的膜中央加入80 μl 56℃温育的Buffer TE，盖上管盖，室温静置1分钟，12000 rpm离心30秒。

10. 弃纯化柱，洗脱的DNA在微量紫外分光光度计上测量浓度。

（三）PCR扩增

1.用ddH₂O将引物稀释到10μM。

2.按下表配制PCR扩增体系：

按5管的量配制混合液，并以每管35 μl分至4个离心管（PCR反应管）中。

* 其中有一管是阴性对照组。

3.向其中一管PCR反应体系的混合液中加入5 μl ddH₂O 作为阴性对照组，剩余的加入5μl 提取的DNA，标好序号，充分混匀，简短离心以收集残留在管壁的液体。

4.进行PCR扩增，反应参数如下：

三、实验结果：

1.在微量紫外分光光度计上用Buffer TE调零，测量洗脱下来的DNA，结果如下：

2.配制2%的琼脂糖凝胶，依次加入5 μl待检样本DNA扩增产物、5 μl DL 2000 DNA Marker和阴性对照，接通电源，电泳30分钟，结果如下：

1：2017.12.13样本  2：2017.12.21样本   3：2018.01.20样本   4：阴性对照M：DL 2000 DNA Marker                 

1. 干粉中确实存在一些细菌或真菌，经过培养后能提取到浓度不低的DNA。

2. 电泳结果显示均未出现亮条带，说明三包干粉中都不存在目的菌种。