如何从血凝块中提取DNA

一.实验目的：

从血凝块中提取DNA。

二.实验材料：

两个血凝块样本、手术刀、血凝块DNA纯化试剂盒（Simgen，Cat.No.4201050）、2×Taq Plus PCR Master Mix（Simgen，Cat.No.7005100）、Human β-globin gene引物（Forward：TTAGGCCTTAGCGGGCTTAGAC；Reverse：CCAGGATTTTTGATGGGACACG）。

三.实验方法：

本次实验采用Simgen的血凝块DNA纯化试剂盒方法来提取血凝块DNA，步骤如下：

1. 用手术刀切取300~400 mg血凝块，转移血凝块到1.5 ml离心管中；

2. 根据血凝块的体积（按1 mg =1 μl换算），补加Buffer PL至终体积为500 μl；

3. 加入20 μl蛋白酶K贮存液，再加入15 μl Buffer SP，旋涡振荡约15秒混匀。

4. 56°C水浴15分钟；

5. 加入375 μl Buffer L1，盖上管盖，旋涡振荡30秒；

6. 加入375 μl Buffer L2，剧烈摇晃离心管3~5次，再旋涡振荡30秒混匀。 13000 rpm 离心5分钟；

7. 吸取750 μl离心上清液加入核酸纯化柱中，离心去滤液；

8. 依次用500 μl Buffer WA和600 μl Buffer WB过柱洗涤；

9. 最高速离心，去除纯化柱上残留的乙醇；

10.将核酸纯化柱置于一个洁净的1.5 ml 离心管中，用60 μl 56℃预热的Buffer TE洗脱DNA；

11.在微量紫外分光光度计上测量DNA的浓度；

12.用2×Taq Plus PCR Master Mix扩增Human β-globin gene，目的基因长约1.3kb。

13.琼脂糖凝胶电泳。

四.实验结果：

1．在微量紫外分光光度计上用Buffer TE调零，测量洗脱下来的DNA，结果如下：

2．在1%的琼脂糖凝胶上，加入8 μl提取到的血凝块基因组DNA，电泳20分钟，结果如下：

M：DL15000 DNA Marker

1、2：血凝块DNA

3．在1%的琼脂糖凝胶上，加入5μl PCR 扩增产物，电泳15分钟，结果如下：

M：DL2000 DNA Marker

1：阳性对照扩增产物

2、3：血凝块DNA扩增产物

五.实验结论：

1．用Simgen血凝块DNA纯化试剂盒从约350mg血凝块中提取到了约10μg DNA。DNA的纯度很好，A260/A280接近1.8；盐分残留很低，A260/A230接近2.5。

2．基因组DNA电泳检测显示比较完整，拖尾较少，主带明显。

3．从血凝块中提取到的基因组DNA用作模板进行PCR扩增，效果良好。

六.讨论：

市场上大部分品牌的血凝块DNA提取试剂盒在提取DNA前都需要将预先血凝块研磨再提取DNA，操作极为不便，并且提取到的DNA有降解现象（见网址链接http://www.dxy.cn/bbs/topic/33224165?source=rss）。Simgen血凝块DNA纯化试剂盒由于采用了其专利技术（国家发明专利号： ZL 201410377744.5），可容忍血凝块样本在溶解不完全的前提下提取DNA，所以无需研磨步骤，只需用蛋白酶K消化血凝块即可，操作起来相对而言非常简便快速。