为什么我的凝胶DNA回收率低（--续）

 近日来，公司再次接到凝胶回收效率低的反馈，经过深入探究客户反映的问题，小编发现很多用户都是将扩增产物直接测浓度后估算回收效率的，并且回收的DNA浓度也各不相同，于是设计一系列相关模拟实验，如下：

用于回收DNA的样本：

1. 陈旧细菌细胞中提取的pMD18 的单酶切产物，含部分降解的DNA，用以模拟含有部分引物二聚体或有非特异扩增的PCR扩增产物，如下图

2. 经过DNA纯化试剂盒（Simgen Cat.No. 2101050）纯化后的陈旧细菌细胞中提取的pMD18 的单酶切产物；

3. 正常pMD18的单酶切产物，只有单条带的DNA，用以模拟只有特异性扩增的PCR产物；

4. 经过DNA纯化试剂盒（Simgen Cat.No. 2101050）纯化后的正常pMD18 的单酶切产物；

实验设备：

台式小量离心机、水浴锅、电泳设备、恒温培养箱、Sim-100微量紫外分光光度计。

实验方法：

此实验分两批进行：

第一批是陈旧细菌细胞中提取的pMD18 的单酶切产物及其纯化产物为样本，

第二批是正常pMD18 的单酶切产物及其纯化产物为样本。

将酶切产物及酶切纯化产物按2μg、1μg、500ng及100ng上样量电泳后做DNA凝胶回收（试剂盒为Simgen Cat.No. 2001050）实验。实验组分A组（纯化前酶切产物）、B组（纯化后酶切产物），C组（对照组，按B组设计的DNA加入量，与150μl融化的琼脂糖凝胶混合，冷却凝固后作为无损失的含DNA凝胶块）。

样本电泳加样顺序：

将A、B、C 三组按照凝胶DNA回收试剂盒说明书进行操作，所回收的DNA用25μl Buffer TE洗脱，并测OD值。

实验测试结果如下：

从上表结果可分析得到：

1.  100 ng上样量的回收率有很大跳动，甚至有的看似回收率超过100%，估计是因为在DNA浓度过低（<10ng/μl）时，分光光度计测到的OD值会出现很大的偏差，因此100 ng上样量测得的回收率不能作为有效的分析数据。

2.  实验组中拖尾pMD18单酶切产物的回收率均低于正常pMD18单酶切产物，可以解释为陈旧样本中所含的小片段降解DNA，在切胶时这些拖尾带未被切下，造成了DNA的损失；

3.  实验组中纯化前样本的回收率均低于纯化后样本。是因为酶切后溶液中有组份（比如水解后的单核苷酸）提高了OD260的吸光度，因而纯化后的DNA样本的OD260的吸光度更为真实。

最后我们可以得出结论：

1. 以OD260的吸收值来判定凝胶DNA回收试剂盒的回收效率并不科学，因为有很多因素会影响OD值，如PCR体系中的多余引物、dNTPS及非特异扩增产物等。

2. 如果要精确测试凝胶DNA回收试剂盒回收效率，应先确保DNA样本中没有其他杂质或核酸干扰OD260的吸收值。

3. DNA上样量不能过低，如果有可能，应将全部的PCR扩增产物上样电泳，否则分光光度计在测试10ng/μl以下浓度的核酸时，计算回收率时会出现严重的偏差。