寻找PCR扩增的污染源

近段时间，小新在做荧光探针检测实验时，阴性对照经常起线，也就是我们常说的“阴性抬头”现象。

经过总结发现有个规律：阴性对照起线的CT值都很大，并且也不是每次实验阴性对照都会起线。

于是开始怀疑是环境中有扩增产物的污染，但是我们的PCR实验室是严格按照三区隔离要求建设的，实验操作也都是按照要求进行操作的，为什么还会有污染？这个污染究竟是从何而来的呢？

仔细回想了一下，之前小新由于好奇心，在某一次荧光扩增完成之后，将扩增产物拿去电泳了，难道就是由此在环境中形成了气溶胶污染？

虽然电泳室也有专门的负压通风系统，也远离PCR实验室，但是电泳室隔壁的DNA实验室是开放式的，人员流动量大，气溶胶还是有可能从DNA实验室通过人员流动带入PCR实验室的。

为了验证这个猜想是否正确，小新设计了一个实验方法，接下来就让我们看看到底是不是这个原因造成的污染吧。

一、实验目的

验证阴性对照中的污染源来源。

二、实验材料

2×Probe qPCR Mix（Simgen Cat.No.7206100，Lot No.：20230229）

台式小量离心机（eppendorf Centrifuge 5415D）

旋涡振荡器(杭州米欧仪器有限公司XH-C)

电子恒温不锈钢水浴锅（上海宜昌仪器纱筛厂）

超微量分光光度计（Simgen Cat.No.Sim-100）

超微量电子天平（福州华科电子仪器有限公司TP-213）

电泳仪（北京六一仪器厂DYY-6C型）

荧光PCR仪（ABI PRISM®7500）

三、实验方法

1. 对照组：让生产技术员在远离PCR实验室的阴性生产车间用新开封的2×Probe qPCR Mix、引物、探针，按照下表配置荧光PCR反应体系（不添加模板DNA），共8管。

2. 测试组：小新在DNA实验室同时用同一批次新开封的2×Probe qPCR Mix、引物、探针，按照下表配置荧光PCR反应体系（不添加模板DNA），共8管。

3. 在ABI PRISM®7500荧光PCR仪中进行荧光定量PCR。实验参数如下：

Stage 1： 预变性（Reps：1）

95℃  30秒

Stage 2： PCR反应（Reps：40）

95℃  10秒

60℃  30秒

四、实验结果

荧光PCR扩增结果如下图：

五、实验结论

1. 从图中可以得知对照组的8个样本均未起线，说明新拆封的试剂、以及阴性生产车间都是没有污染源的。而测试组的8个样本中除了2个样本未起线外，其余6个样本均起线了，更重要的是这6个起线样本中有2个样本的CT值都接近34了，而原来在PCR室配制的阴性PCR反应体系扩增出现的阳性CT值无一例外都是大于35的。现在基本上可以判定DNA实验室就是环境中污染源的源头了，当然DNA实验室的污染又来自隔壁的电泳室。

2. 这次实验让我们见识了气溶胶的厉害，竟然在我们专业的PCR实验都碰到气溶胶的污染！所以说，PCR检测的超高灵敏度是把双刃剑，要应用这一技术的超高灵敏度，就必须注意实验过程中的每一个可能导致扩增产物污染的环节。为此，我们实验室立即启动了下述几项应急的纠正预防措施：

1） DNA实验室开窗、开门通风，持续两周时间以上。

2） 下班时间PCR实验室、DNA实验室用紫外线照射，持续一周时间。

3） 暂停相关检测实验，除阴性车间拆封过的试剂外，其他相关的检测试剂全部丢弃。

4） 荧光PCR检测后的产物原则上不允许开盖电泳检测。如果有需求，则要求在电泳结束后及时开启紫外灯变性可能存在环境中的气溶胶，同时更换电泳缓冲液，然后还须将扩增产物、凝胶、吸头单独用自封袋密封后再丢弃。

5） 严格遵循在不同实验室工作需要更换不同工作服的规定。

3. 荧光PCR检测理论上能检测到1个DNA分子，所以同学们请牢记一点，如无必要请千万不要开盖、不要开盖、不要开盖！！！----重要的事情说三遍。否则一旦发现实验环境出现气溶胶污染了，就需要更换试剂，紫外线照射，实验室通风，非常之麻烦，即便有专用的电泳室，也不要轻易尝试。