如何从唾液中提取细菌DNA

人每天分泌唾液在1.0-1.5 L左右,里面包含大量的消化酶、溶菌酶、免疫球蛋白、各种无机盐离子以及白细胞、口腔脱落细胞、各种菌体细胞甚至是病毒，唾液样本分析是人体健康的重要指标之一。而唾液样本采集作为一种对人体无伤害、无痛苦采集方法，也更容易被广泛接受。唾液中含有丰富的DNA，在一个如此庞大且丰富的背景下检测相对含量很低的单一细菌DNA是很难的。所以问题来了，我们要如何从大量的唾液样本中提取出微量的细菌DNA呢？

首先我们来计算一下，我们要提取的DNA到底有多少？1 ml唾液大约含1亿个细菌，看似数量庞大，然而将它们的DNA全部提出来也不足1 μg，更何况人体唾液中的细菌种类繁多，据相关文献所述，人口腔细菌多达800多种，平均下来每种细菌DNA的含量已经是痕量级的了，而1 ml唾液中人的DNA含量在20 μg左右，这是好几个数量级的差距啊！

关于提取临床样本细菌DNA，比较保守的方法就是煮沸法，因为煮沸法一管操作，简单快速，省时省力，当然煮沸法也存在着不可忽视的缺陷，这在我们下面的对比实验中会一一体现出来。我们本次的实验就是对比煮沸法和Simgen口腔拭子细菌纯化试剂盒两种方法分别从唾液中提取细菌DNA，谁更胜一筹呢？

实验材料及试剂：

枯草芽孢杆菌及相应特异性引物、唾液、煮沸法试剂、口腔拭子DNA纯化试剂盒（cat.no4300050.）、2×SYBR Green PCR Mix（Simgen，cat.no.7106100）

实验设备：

水浴锅、高速离心机、移液器及荧光PCR仪

实验方法：

1、枯草芽孢杆菌挑单菌落于5 ml LB培养基中，37℃ 220 rpm过夜培养，为了模拟出唾液中微量细菌DNA的效果，我们用唾液按10倍梯度稀释培养后的菌液，取10^-3、10^-4、10^-5、10^-6四个梯度作为提取样本进行实验。我们使用Simgen口腔拭子细菌DNA纯化试剂盒和煮沸法各提一组梯度样本。

2、煮沸法操作非常简单：取50 μl煮沸法试剂加50 μl样本，100℃水浴10 min，12000 rpm离心吸取取50 μl上清。

3、Simgen口腔拭子细菌DNA纯化试剂盒方法：①取180 μl样本加入20 μl Buffer A10和20 μl蛋白酶K贮存液，56℃ 水浴10 min。②加入500 μl Buffer AC，旋涡震荡数秒混匀，过核酸纯化柱，12000 rpm离心30 s。③弃滤液，加入700 μl Buffer WBR，12000 rpm离心30 s。④14000 rpm空离1 min。⑤加入50 μl Buffer TE洗脱DNA。

4、将洗脱下来的DNA进行荧光定量PCR检测。

反应体系：

 反应条件：

 Stage 1：预变性        Reps：1

                 95℃   1 min

 Stage 2：PCR 反应     Reps：40

                 95℃   5 s

                 60℃  33 s

 Stage 3：融解曲线绘制  Reps：1

                 95℃   15 s

                 60℃   20 s

                 95℃   15 s

实验结果：

从上面三张图片我们可以看出，煮沸法和Simgen试剂盒法荧光PCR曲线相关性都很好，但是暴露了煮沸法其中一个致命的缺陷：检测灵敏度低。如图一所示，当以从10^-6稀释样本中提取的DNA作为荧光PCR模板时，没有检测到阳性。而在图二中，用Simgen试剂盒的方法，阳性很明显。如果患者唾液内的致病菌含量低于一定量的时候，使用煮沸法很有可能放过这个凶手。

我们再来看一下煮沸法和Simgen试剂盒法在不同浓度梯度PCR曲线的对比，Simgen试剂盒法的灵敏度明显比煮沸法高：

从四张对比图中可以看出，每一个梯度Simgen试剂盒法都比煮沸法Ct值小3-4个。说明Simgen试剂盒法提取的模板DNA的浓度是煮沸法的10-16倍。回溯DNA提取的过程，这个差异也能找到一定的解释：煮沸法样本初始体积是50 μl，核酸终体积100μl，稀释了1倍；Simgen试剂盒法样本初始体积是180 μl，核酸终体积50 μl，浓缩了3.6倍。在提取效率100%的情况下，Simgen试剂盒法最后提取的核酸浓度应该是煮沸法的7.2倍。算上核酸提取效率上的差异，实际实验中相差10-16倍也可以理解。

新景生物实验室