增大Carrier RNA用量能否提高病毒核酸检测的灵敏度？

因为新冠疫情，越来越多的核酸诊断试剂厂家了解到Carrier RNA的重要性——它能够在病毒核酸提取的过程中，提高病毒核酸的回收效率，减少RNA被RNA酶降解的几率，大大提高了后续检测的灵敏度，是痕量核酸提取中必不可少的重要组分。

既然Carrier RNA作用这么大，是不是用的越多越好呢？我们了解下一些知名品牌的试剂盒中Carrier RNA的用量，QIAGEN的QIAamp MinElute Virus Spin Kit和TIANGEN的病毒基因组DNA/RNA提取试剂盒每次提取Carrier RNA的用量均为5.6 μg，TaKaRa的MiniBEST Viral RNA/DNA Extraction Kit每次提取Carrier RNA的用量为6 μg。几家公司每次样本使用的Carrier RNA都在5~6 μg之间，但是如果每次加入更多的Carrier RNA，效果会更好吗？

一、 实验目的

测试增大Carrier RNA用量对病毒核酸检测灵敏度的影响。

二、 实验仪器及试剂

仪器：

荧光定量PCR仪（ABI PRISM® 7500 Sequence DeteCtion System）

台式小量离心机（eppendorf Centrifuge 5415 D）

迷你金属水浴锅（杭州米欧仪器）

旋涡震荡器（越新仪器，XH-C）

试剂：

人血浆

新冠假病毒（10⁸ copies/ml）

猪DNA溶液 （100 ng/μl）

病毒核酸纯化试剂盒（Simgen,Cat.NO.4002050）

2×One Step Probe RT-PCR Mix（Simgen,Cat.NO.7406100）

新冠病毒引物及探针（F:CCCTGTGGGTTTTACACTTAA/R:ACGATTGTGCATCAGCTGA，Probe:5′FAM-CCGTCTGCGGTATGTGGAAAGGTTATGG-BHQ1′3）

2×Probe qPCR Mix（Simgen,Cat.NO.7206100）

猪特异性引物及探针（F:CGACAAAGCAACCCTCACAC/R:TGCGAGGGCGGTAATGAT，Probe:5′FAM-CTTCGCCTTCCACTTTATCCTGCCATTC-BHQ1-3′）

三、 实验步骤与结果分析

（一）用新冠假病毒代替RNA病毒测试

1. 用血浆将假病毒稀释至10⁶ copies/ml。

2. 向Buffer VL中加入Carrier RNA，每500μl的Buffer VL中分别加入5μl、10μl和15μl 浓度为2.5μg/μl的Carrier RNA（相当于每次提取用了5 μg、10 μg、15 μg的Carrier RNA）。

3. 取6个1.5ml离心管，分别加入20 μl 蛋白酶K 贮存液，再加入200 μl血浆。

4. 每管加入200 μl含Carrier RNA的Buffer VL（每种用量各做两管测试） ，旋涡振荡约15 秒混匀。

5. 56℃水浴10 分钟。

6. 加入320 μl无水乙醇，温和地翻转4~6 次混合均匀 。

7. 将溶液转移到核酸纯化柱中离心去滤液；

8. 加入700 μl Buffer WBR，离心去滤液；

9. 14000rpm空离1分钟去除残留液体；

10. 弃 2 ml 离心管，将核酸纯化柱置于一个洁净的 1.5 ml 离心管中，在纯化柱膜中央加入50 μl 56℃预热的 Buffer TE ，盖上管盖，室温静置1分钟，离心得到假病毒RNA；

11. 用2×One Step Probe RT-PCR Mix、新冠病毒引物及探针配置反应液，用洗脱的5 μl假病毒RNA为模板进行荧光PCR。

荧光PCR扩增曲线及CT值如下：

从CT值可知，Carrier RNA的用量增加到10 μg、15 μg时，与5 μg Carrier RNA用量的曲线对比，后续RT-PCR反应增大了3~4个CT值，并且15 μg和10 μg Carrier RNA用量的两个条件之间的CT值差异不是很大。说明在RNA病毒的检测中，提高Carrier RNA的用量不仅没有提高检测灵敏度，反而降低了检测的灵敏度。

（二）用猪DNA代替DNA病毒测试

用血浆将猪DNA稀释10³倍，用病毒核酸纯化试剂盒提取DNA，方法步骤和上文提取新冠假病毒一样，最后用2×Probe qPCR Mix对猪DNA进行荧光PCR扩增。

扩增曲线及CT值如下：

从CT值可知，Carrier RNA的用量增加到10 μg、15 μg时，后续PCR反应的CT值确实变小了一些，但是变化幅度很小，甚至不排除这种减少是孔间差异所造成的。因此提高Carrier RNA的用量对后续病毒DNA的检测灵敏度几乎没有影响。

四、 分析与讨论

1. 从新冠假病毒测试结果可以得出结论，同一个样本用于RNA病毒检测时，如果Carrier RNA的每次用量超过5 μg的，后续RT-PCR反应的CT值会变大，反而降低了检测灵敏度。

2. 从猪DNA的测试结果可以得出结论，同一个样本用于DNA病毒检测时， Carrier RNA的用量加大后，CT值变化不明显，对后续检测灵敏度的影响不大。

3. Carrier RNA能提高痕量核酸的回收效率这一点我们是很明确的，理论上增大Carrier RNA不会降低病毒RNA的回收效率，为什么后续RT-PCR的CT值会减小（CT值增大也可以解读为回收到的核酸中病毒RNA减少）呢？在模拟病毒DNA回收的实验中，加大Carrier RNA并未观察到CT值减小的结果，可以推断出在病毒RNA回收实验中，提高Carrier RNA的用量也不会减少病毒RNA的回收效率。所以我们猜测最大的可能性是源自于病毒RNA在逆转录步骤中受到了干扰，过量的Carrier RNA干扰了逆转录酶的工作效率，所以现象出来的结果就是CT值变大了。

Carrier RNA虽然对痕量核酸提取的帮助非常大，但看来也不是加得越多越好的，加多了成本肯定会增加，而且用于DNA病毒检测灵敏度没有多少提升，用于RNA病毒检测反而出现降低检测灵敏度的情况。所以面对DNA样本还是RNA样本的核酸提取，大家在决定实验中Carrier RNA的使用量时要区别对待，特别是RNA样本，必须要考虑回收到的RNA中的Carrier RNA对后续RT-PCR体系的影响。也就是说，Carrier  RNA的最佳用量除了参考市场上商品化试剂盒的使用量外，还应该要根据后续配套的RT-PCR体系一起验证才能最终确定。