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众所周知，RNA非常脆弱，因为环境中到处都有它的天敌——RNA酶，一不小心RNA就被降解了。而RNase Inhibitor的出现很好地解决了这一问题，它能与RNA酶结合，抑制RNA酶的活性，从而保护RNA，因此在很多RT-PCR实验中，添加RNase Inhibitor是必须的，那么如何判断RNase Inhibitor的性能效果呢？今天我们就给大家介绍两种RNase Inhibitor性能检测方法。
一、实验目的：
用不同方法对RNase Inhibitor性能效果进行检测。
二、实验材料：
1. 检测RNase Inhibitor（两种方法检测的不是同一批次）和对照RNase Inhibitor（40 U/μl）
2. RNase A：50 mg/ml（Simgen Cat.No.8001001）
3. RNA样本：大鼠肌肉组织RNA、Carrier RNA
4. Rat β-acting引物（Forward：CCCATCTATGAGGGTTACGC/Reverse：TTTAATGTCACGCACGATTTC）
5. cDNA第一链合成试剂盒（Simgen Cat.No.7306025）、2×SYBR Green PCR Mix（Simgen Cat.No.7106100）
6. 荧光PCR仪（ABI 7000）
7. PCR仪（Techne FPROGO5Y Progene Thermal）
8. 台式离心机（eppendorf Centrifuge 5415 D）
9. 电泳仪（北京六一仪器厂，DYY-6C型 ）
三、实验方法与结果：
方法一：荧光PCR法
1. 将RNase A梯度稀释至5 ng/μl；
2. 将cDNA第一链合成试剂盒中的试剂、大鼠RNA（317 ng/μl）、2×SYBR Green PCR Mix、引物在室温（15-25℃）解冻，解冻后迅速置于冰上。使用前将每种溶液混匀，简短离心。
3. 按照表1的基因组DNA去除体系配制混合液，彻底混匀。简短离心，并置于37℃，孵育30 min，以保证RNase A有充分时间去降解RNA。然后置于42℃，孵育3 min，置于冰上放置。
编号 试剂 | 阴性对照 | 对照组 | 检测组 | 空白对照 | ||||
1 | 2 | 3 | 4 | 5 | 6 | 7 | 8 | |
5×gDNA Buffer（μl） | 2 | 2 | 2 | 2 | 2 | 2 | 2 | 2 |
RNA（μl） | 3 | 3 | 3 | 3 | 3 | 3 | 3 | 3 |
RNase A（ng） | 1.6 | 1.6 | 1.6 | 1.6 | 1.6 | 1.6 | -- | -- |
RNase Inhibitor（μl） | -- | -- | 1 | 1 | 1 | 1 | -- | -- |
RNA-Free H2O（μl） | 补足到10μl | |||||||
注：为避免RNA与RNase A接触提前发生降解，预先将RNase Inhibitor与RNase A按比例混合后再加入体系。
4、按照表2的反转录反应体系配制混合液。
5× RT Buffer | 4μl |
RT Enzyme Mix | 2μl |
RT Primer Mix | 4μl |
表2 反转录反应体系
5、将反转录反应体系中的混合液，加到gDNA去除反应体系的混合液中，充分混匀，简短离心以收集残留在管壁的液体。
6、42℃，孵育15 min。
7、95℃，孵育3 min之后放于冰上。
8、用2×SYBR Green PCR Mix、Rat β-acting引物配置反应液，取5 μl cDNA进行荧光PCR检测。
根据扩增结果可知，阴性对照组（1、2）CT值为25.78和25.04，平均值为25.41，对照组（3、4）CT值为20.03和19.84，平均值为19.935，检测组（5、6）CT值为21.70和21.34，平均值为21.52，空白对照组（7、8）CT值为19.28和19.56，平均值为19.42。由此得出结论，阴性对照组CT值比空白对照组CT值大，说明其中的RNA有部分被RNase A降解了；而检测组CT值比阴性对照组CT值小，比对照组CT值大，说明检测组的RNase Inhibitor确实起到了抑制RNase A的作用，但效果没有对照组好。实验结果：
方法二：电泳法
1. 将RNase A（50 mg/ml）稀释至10 ng/ul、1 ng/ul、0.1 ng/ul、0.01 ng/ul，按下表配置反应体系，两组检测组（检测RNase Inhibitor和对照RNase Inhibitor），一组阴性对照（不加RNase Inhibitor）以及一组空白对照组，平行做两管。
检测组 | Rnase A （10 ng/ul） | Rnase A （1 ng/ul） | Rnase A （0.1 ng/ul） | Rnase A （0.01 ng/ul） |
5xRT Buffer | 4μl | 4μl | 4μl | 4μl |
RNase Inhibitor | 1μl | 1μl | 1μl | 1μl |
Rnase A | 2μl | 2μl | 2μl | 2μl |
RNA（500 ng/μl） | 1μl | 1μl | 1μl | 1μl |
RNase-free Water | 12μl | 12μl | 12μl | 12μl |
阴性对照 | Rnase A （10 ng/ul） | Rnase A （1 ng/ul） | Rnase A （0.1 ng/ul） | Rnase A （0.01 ng/ul） |
5xRT Buffer | 4μl | 4μl | 4μl | 4μl |
RNase Inhibitor | - | - | - | - |
Rnase A | 2μl | 2μl | 2μl | 2μl |
RNA（500 ng/μl） | 1μl | 1μl | 1μl | 1μl |
RNase-free Water | 13μl | 13μl | 13μl | 13μl |
空白对照组 |
|
RNA（500 ng/μl） | 1μl |
RNase-free Water | 19μl |
3. 取5 ul混液+1 ul 6×Loading Buffer，进行琼脂糖凝胶电泳。
四、实验结果：
从电泳结果分析，加了RNA酶的样本，随着RNase A浓度的减少，降解更慢，从降解情况看，对照组RNase Inhibitor和检测组RNase Inhibitor效果差不多。
五、讨论与分析：
1. 两种方法都可以对RNase Inhibitor的效果性能进行一种有效的检测。荧光法比较直观，可以准确的通过CT值大小得出结论；电泳法相对而言实验结果没有荧光PCR法准确，只能简单通过肉眼判断差异，但是胜在操作更加简单、方便快捷。
2. 如果想要精确判断检测的RNase Inhibitor具体活力浓度，推荐使用荧光PCR法；如果只想粗略判断RNase Inhibitor效果，则可以使用电泳法。