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受新冠疫情的影响，病毒样本保存液的市场需求量突然剧增，市面上也相继出现了一批批病毒保存液。但是这些保存液良莠不齐，有的不能室温保存，增加了保存和运输成本；有的没有灭活病毒作用，增加了检测人员的感染风险；有的甚至保存效果不佳，严重影响了后续检测灵敏度。现阶段的样本采集大多还是采用拭子采样，但是这种侵入性的样本采集方法颇为“痛苦”，特别不适合儿童或者婴幼儿的采样。因此国外最近开始大量使用唾液采样代替拭子采样来进行新冠病毒检测了，并且该方法已被证明与当前的拭子采样具有同等的敏感性和特异性。
前段时间就有客户询问能否用我们的RNA样本保存液保存唾液中的病毒样本。但是考虑到RNA样本保存液通常用于组织样本，对于唾液样本的保存可能不太理想，因此我们专门研发了一款适用于液体样本中病毒RNA保存的新产品——病毒样本保存液。下面让我们对比一下新研发的病毒样本保存液和RNA样本保存液在唾液样本中病毒RNA保存方面的效果差异。
一、实验目的：
对比病毒样本保存液和RNA样本保存液对唾液样本中病毒RNA的保存效果差异。
二、实验材料：
1. 病毒样本保存液（Simgen Cat.No.4112100）
2. RNA样本保存液（Simgen Cat.No.4007020）
3. Carrier RNA（Simgen Cat.No.4003101）
4. 新鲜采集的唾液
5. 电热恒温培养箱（上海精宏实验设备有限公司，DNP-9082）
6. 旋涡震荡器（越新仪器，XH-C）
7. 台式离心机（eppendorf Centrifuge 5415 D）
8. 超微量分光光度计（Simgen Cat.No.sim100）
9. 电泳仪（北京六一仪器厂，DYY-6C型）
三、实验方法：
用添加了Carrier RNA的唾液与保存液按比例混合，放入37℃恒温箱中，每隔一周提取一次RNA，观察保存液的保存效果。
RNA样本保存液：唾液=3:1 | 病毒样本保存液 ：唾液=2：1 |
1. 将混合液上下翻转混合均匀，吸取100 μl混合液到RNase-free的1.5 ml离心管中，加入300 μl裂解液，旋涡振荡数秒混合均匀，室温静置10分钟； 2. 加入320 μl无水乙醇，温和地翻转离心管3~5次混合均匀； 3. 稍离，吸取液体到核酸纯化柱中，13000 rpm离心30秒，弃滤液； 4. 在核酸纯化柱中加入600 μl Buffer WA，离心弃滤液； 5. 在核酸纯化柱中加入700 μl Buffer WBR，离心弃滤液； 6. 14000 rpm离心1分钟去除残留液体； 7. 将核酸纯化柱置于一个RNase-free的1.5 ml离心管中，加入50 μl RNase Free Water，室温静置1分钟，离心洗脱得到RNA。 | 1. 将混合液上下翻转混合均匀，吸取300 μl混合液到RNase-free的1.5 ml离心管中，13000 rpm离心2 min； 2. 吸取上清到新的1.5 ml离心管中，加入300 μl 70%乙醇，温和地翻转离心管3~5次混合均匀； 3. 稍离，吸取液体到核酸纯化柱中，13000 rpm离心30秒，弃滤液； 4. 在核酸纯化柱中加入600 μl Buffer WA，离心弃滤液； 5. 在核酸纯化柱中加入700 μl Buffer WBR，离心弃滤液； 6. 14000 rpm离心1分钟去除残留液体； 7. 将核酸纯化柱置于一个RNase-free的1.5 ml离心管中，加入200 μl RNase Free Water，室温静置1分钟，离心洗脱得到RNA。 |
8. 将提取到的RNA在超微量分光光度计上测量浓度，并进行琼脂糖凝胶RNA电泳检测。 | |
四、实验结果：
1. 在超微量分光光度计上用RNase Free Water调零，测量洗脱下来的RNA，结果如下：
37℃保存1周后的结果：
37℃保存2周后的结果：
1、2是RNA样本保存液保存的唾液样本提取的RNA；
3、4是病毒样本保存液保存的唾液样本提取的RNA。
2. 在1%的琼脂糖凝胶上，加入8 μl提取到的RNA，电泳25分钟左右，结果如下：
五、讨论与分析：
1. 从操作步骤分析，用RNA样本保存液保存的样本后续提取操作稍显复杂，需要用到裂解液，且起始样本量低，一次提取能够得到的RNA量较少；而用病毒样本保存液保存的样本后续提取更加方便，无需裂解液，且起始样本量大，一次提取使用的唾液样本量相当于用RNA样本保存液保存的唾液样本的4倍，这对后续检测来说相当于提高了检测灵敏度。
2. 因为病毒样本保存液起始唾液样本的用量相当于RNA样本保存液的4倍，因此为了方便比较，将病毒样本保存液提取的样本的洗脱体积增加到200 μl。从浓度测量结果显示，用病毒样本保存液保存的样本提取的浓度更高，且随着37℃放置时间的增加，浓度数值减少的趋势明显小于RNA样本保存液保存的样本，说明病毒样本保存液保存唾液中RNA的效果比RNA样本保存液更稳定。
3. 从电泳图分析，用病毒样本保存液保存的样本提取到的Carrier RNA条带明显比RNA样本保存液保存的样本提取到的条带要亮，这与测得的浓度有很好的对应关系。两种保存液提取的Carrier RNA随着在37℃放置时间的增加，降解情况变化不大，说明两种保存液均能在室温环境（≤37℃）下保护RNA不被水解。
综上，两种保存液均能室温保存唾液样本中的RNA，且在2周内没有明显差异。相比较而言病毒样本保存液能提取的起始样本更多，如果用于新冠病毒RNA的核酸检测灵敏度应该更高。当然这只是用Carrier RNA测试的结果，如果用RNA病毒测试又会有什么样的结果呢，敬请期待下期实验结果。