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在痕量级（pg至ng级别）核酸的分离、纯化过程中，不论是经典的酚氯仿抽提+醇沉淀，或者是现在市场上主流的硅胶膜法或磁珠法，回收率都会严重降低，最多的能损失90%的核酸。如果在痕量核酸提取体系中额外添加Carrier RNA，其结果就是将痕量级的核酸分离纯化体系重新还原到μg级别核酸的分离纯化体系。如果用荧光定量PCR检测回收的痕量核酸，其结果就是添加Carrier RNA的检测结果会明显减小3~4个CT值。病毒核酸回收体系是业界公认的痕量级核酸回收体系，一家核酸诊断试剂公司提供的病毒核酸提取体系是否有添加Carrier RNA，几乎可以直接推断出该企业提供的病毒核酸检测产品的灵敏度。因此2020年的新冠病毒疫情导致Simgen的Carrier RNA一跃成为了公司的明星产品。由于很多用户向我们询问“Carrier RNA室温能放多久”、“寄到的时候冰袋不冷了，Carrier RNA还能用吗”等诸多问题，所以我们特地耗时2个月专门对Carrier RNA进行了真实稳定性测试。
一、实验目的：
测试Carrier RNA的稳定性：37℃环境下存放的液体Carrier RNA对使用性能的影响。
二、实验材料与设备：
Carrier RNA（Simgen Cat.No.4003101）
RNA保护剂（Simgen Cat.No.4006030）
DL 2000 Marker (Simgen Cat.No.MD1006 )
电热恒温培养箱（上虞市沪越仪器设备厂，DHG 303-0）
电泳仪（北京六一仪器厂，DYY-6C型 ）
病毒核酸提取试剂盒（Simgen Cat.No.4002050）
台式离心机（eppendorf Centrifuge 5415 D）
2×One Step Probe RT-PCR Mix（Simgen Cat.No.7406100）
荧光定量PCR仪（ABI 7500）
新冠病毒引物及探针（F:CCCTGTGGGTTTTACACTTAA/R:ACGATTGTGCATCAGCTGA,
Probe:5′FAM-CCGTCTGCGGTATGTGGAAAGGTTATGG-BHQ1′3）
新冠假病毒（用血清稀释到106 copies/ml）
三、实验内容：
1. 取两支同一批次的Carrier RNA（1 ml），一支放置于﹣20℃冰箱保存，一支放置于37℃恒温箱保存。
2. 每天取出两支Carrier RNA，各吸取10 μl用RNA保护剂稀释60倍，混匀。
3. 各取5 μl加入1%的琼脂糖凝胶中，加入5 μl DL 2000 Marker，电泳20 min，观察条带情况。
4. 实验进行一段时间后，分别用添加了这两支Carrier RNA的Simgen病毒核酸提取试剂盒提取血清中的新冠假病毒，并使用2×One Step Probe RT-PCR Mix进行扩增测试。
四、实验结果：
1. 电泳结果：（由于图片较多，且很多图片中的Carrier RNA条带情况相差不大，因此选择了其中变化较明显的图片）
正式实验前先进行了一次电泳测试，因为是同一批次的，此时的两支Carrier RNA电泳条带几乎一样，没有差别。
实验第3天，两支Carrier RNA的条带没有明显差别。
实验第7天，可以看到两支Carrier RNA的条带开始出现差别，37℃保存的Carrier RNA条带出现不太明显的降解情况。
实验第12天，可以看到37℃保存的Carrier RNA降解情况已经较为明显，拖尾情况比前几天要严重一些。
实验第19天，可以看到37℃保存的Carrier RNA降解情况较为严重了，较长的条带已经暗淡了很多。
实验第27天，可以看到37℃保存的Carrier RNA较长的条带只能隐约看到了，降解非常严重。实验第19天，可以看到37℃保存的Carrier RNA降解情况较为严重了，较长的条带已经暗淡了很多。
实验第33天，可以看到37℃保存的Carrier RNA较长的条带几乎看不见了，但是两条带之间的区域还是有拖尾。
实验第46天，可以看到37℃保存的Carrier RNA两条带之间的拖尾也已经降解得快看不到了。
实验第59天（最后一次实验，因为测试用的Carrier RNA使用完了），可以看到此时37℃保存的Carrier RNA状态和之前第46天时差不多，这十多天变化并不是很明显，降解的Carrier RNA片段主要集中在500 nt~1000 nt的位置。实验第46天，可以看到37℃保存的Carrier RNA两条带之间的拖尾也已经降解得快看不到了。
2. 荧光定量PCR结果：（实验第46天（图9）时进行的测试）
3、4是使用﹣20℃保存的Carrier RNA提取的新冠假病毒RNA的RT-qPCR结果；1、2是使用37℃保存的Carrier RNA提取的新冠假病毒RNA的RT-qPCR结果；
5、6是未使用Carrier RNA提取的新冠假病毒RNA的RT-qPCR结果。
五、实验讨论与分析：
1. 结合图1~图10分析可知，由于Carrier RNA是溶解在RNA保护剂中的，所以液体Carrier RNA在37℃条件下存放了接近2周时间才开始观察到较明显的降解现象。如果Carrier RNA放在室温环境下（15-25℃），估计要2周以上才能观察到较为明显的降解现象。当然也说明了液体Carrier RNA如果要长时间稳定保存，还是需要放在﹣20℃。
2. 结合图2~图5可知，液体Carrier RNA在37℃下短期内放置影响不大，至少7天之内Carrier RNA的电泳带型未发生明显的变化。因此即便是用户收到Carrier RNA时发现冰袋已经融化，只要时间不超过7天（除非环境温度高达40~50℃），也并不需要担心产品的使用性能会受到影响。
3. 结合图11可以发现37℃保存过、有降解的Carrier RNA提取的假病毒RNA的RT-qPCR的CT值居然比﹣20℃保存的还要小一些。出现这样的实验结果实在令人费解，但是我们实验室经过多次重复实验，结果仍然是有降解的Carrier RNA用于假病毒RNA提取后RT-qPCR的CT值小于﹣20℃保存的Carrier RNA。所以我们得出的结论是37℃放置了一个多月（46天），电泳观测有降解的Carrier RNA对使用性能仍然没有影响。
4. 结合图9和10的对比，可以观察到37℃下保存46天和59天的Carrier RNA电泳带型差别不大，因此我们估计即便是37℃下保存了2个月的Carrier RNA，对使用性能也还是没有影响。
由于在病毒RNA纯化体系中，如果加入过多的Carrier RNA，对逆转录酶会产生干扰这一点我们是已知的。因此我们猜测，在相同浓度的前提下，可能是降解的Carrier RNA（本质上是片段500 nt~1000 nt范围内的Carrier RNA）比完整的Carrier RNA对逆转录酶的干扰更少，所以在RT-qPCR的结果上显示出来的就是CT值稍微小一些。当然真正的原因，仍然是未知，我们欢迎阅读的同学、老师们提出你们的猜想。