用核酸检测的方法鉴定蕲蛇真伪

蕲蛇是蝰科动物五步蛇的干燥体，具有祛风、通络、止痉的功效。近年来，由于资源有限，价格昂贵，出现了用其他蛇冒充蕲蛇或在蕲蛇体内掺假的现象，因此近些年的《中国药典》中蕲蛇鉴定方法改为聚合酶链式反应法（PCR法）。前段时间江西百仁中药找到了我们，想让我们设计一套方案来鉴定蕲蛇的真伪，并寄来了一些蕲蛇测试样本。现在我们把鉴定真伪蕲蛇的方法分享给大家。

一、实验目的

提取蕲蛇样本中的DNA，用聚合酶链式反应法（PCR法）对蕲蛇进行真伪鉴定。

二、实验材料：

1. 蕲蛇待检样品（晒干的蛇肉）和阳性对照品（粉末状）

2. 动物组织DNA试剂盒（Simgen Cat.No.3101050）

3. 2×Taq plus PCR Master Mix（Simgen Cat.No.7005100）

4. 蕲蛇特异性引物（F:5’-GGCAATTCACTACACAGCCAACATCAACT-3’ /R:5’-CCATAGTCAGGTGGTTAGTGATAC-3’）

5. 超微量电子天平（DENVER INSTRUMENT，TP-213）

6. 电子恒温不锈钢水浴锅（上海宜昌仪器纱筛厂）

7. 旋涡震荡器（越新仪器，XH-C）

8. 台式离心机（eppendorf Centrifuge 5415 D）

9. 超微量分光光度计（SIMGEN Cat.No.sim100）

10. 电泳仪（北京六一仪器厂，DYY-6C型 ）

11. PCR仪（Techne FPROGO5Y Progene Thermal）

三、实验内容：

本次实验使用Simgen动物组织DNA试剂盒提取蕲蛇样本DNA，再用Simgen 2×Taq plus PCR Master Mix扩增提取的DNA，具体步骤如下：

1. 用手术刀从待检样本上刮下一些组织粉末，称取25 mg，转移至1.5 mL离心管中。

2. 加入20 μl蛋白酶K贮存液，再加入180 μl的Buffer AT。

3. 56℃水浴3小时（因为样本已经晒制成干，较难溶解），期间旋涡震荡数次帮助组织溶解。

4. 加入200 μl Buffer SL，旋涡震荡约15秒混匀。将离心管置于70℃水浴10分钟。

5. 12000 rpm离心1分钟，吸取上清液转移到另一个1.5 ml离心管中，加入200 μl无水乙醇，旋涡震荡约15秒混合均匀。

6. 将溶液加入到核酸纯化柱中，12000 rpm离心30秒弃滤液。

7. 加入500 μl Buffer WA，12000 rpm离心30秒弃滤液。

8. 加入600 μl Buffer WB，12000 rpm离心30秒弃滤液。

9. 14000 rpm离心1分钟去除残留液体。

10. 将核酸纯化柱置于一个洁净的1.5 ml离心管中，加入100 μl Buffer TE，室温静置1分钟。

11. 12000 rpm离心30秒洗脱得DNA。

12. 在超微量分光光度计上测量提取到的DNA的浓度。

13. 用2×Taq Plus PCR Master Mix扩增蕲蛇特异性引物，配置体系如下表：

14. PCR反应参数设置为；95℃预变性5 min，循环反应35次（95℃ 30s,63℃ 45s），延伸（72℃）5分钟。

15. 对提取到的DNA和PCR扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳。

四、实验结果：

1. 在超微量分光光度计上用试剂盒中的Buffer TE调零，测量提取好的DNA，结果如下：

样品编号1、2为阳性对照样品提取的DNA；

样品编号3、4为待检蛇肉样品提取的DNA。

2. 在3%的琼脂糖凝胶上，加入5 μl提取到的DNA和扩增产物，电泳30 min，结果如下：

五、实验讨论与分析 

1. 从超微量分光光度计浓度测量结果上分析，不管是阳性对照还是待检蛇肉样本提取到的DNA浓度都不高，只有一管待检蛇肉样本（3号样本）提取的DNA浓度稍高一些。推测可能是蕲蛇在风干或制成粉末的过程中降解了DNA，导致最后提取到的DNA量较少。

2. 从电泳图分析，阳性对照和待检蛇肉样本提取的DNA都看不到明显的条带，只有一管待检蛇肉样本（3号样本）提取的DNA能隐约看到较暗淡的基因组DNA条带，与测得的DNA浓度结果有对应关系。

3. 虽然提取到的DNA浓度低，但并不影响PCR扩增，阳性对照和待检蛇肉样本提取的DNA均成功扩增出了条带，且两者位置一致，证明待检蛇肉样本确实是蕲蛇。

4. 本次PCR扩增中，由于DNA浓度低，相应的增加了模板DNA的用量，达到了15 μl。如此高的模板用量，PCR扩增却没有受到影响，说明了动物组织DNA试剂盒提取的DNA洁净度高，抑制物少。