方法一:
1.取两片幼嫩新鲜叶片,置于预冷的研钵中,倒入适量液氮,迅速研磨成粉末状,随后加入3ml预热的2%CTAB抽提缓冲液和50ul抗氧化剂2-巯基乙醇,继续研磨成略有流动性的糊状或粥状,转入1.5ml的离心管中,于65℃水浴锅中保温约60min。
2.待混合物冷却至室温后加入等600ul的CI(氯仿:异戊醇=24:1)溶液混匀,轻轻颠倒离心管几次使管内混合物成乳浊液,常温下10000rpm离心10min,取上清液转入另一干净的离心管中。
3.重复步骤(2)一次。
4.取步骤(3)上清液加入2.5倍体积无水乙醇,仔细混匀,-20冰箱30min以上,沉淀DNA 4℃,12000rpm离心10min。
5.弃去上层有机溶剂,加500ul75%乙醇洗涤沉淀,4℃下8000rpm离心5min,弃去上清,洗涤沉淀3次。
6.倒置或者37度培养箱烘干。
7.加50ulTE缓冲液溶解DNA,于-20℃冷藏备用。
方法二:
1. 在50ml离心管中加入20ml提取缓冲液Ⅰ, 60℃水浴预热。
2. 植物5-10g, 剪碎, 在研钵中加液氮磨成粉状后立即倒入预热的离心管中, 剧烈摇动混匀, 60℃水浴保温30-60分钟(时间长,DNA产量高), 不时摇动。
3. 加入20ml氯仿/戊醇/乙醇溶液, 颠倒混匀(需带手套, 防止损伤皮肤),室温下静置5-10分钟, 使水相和有机相分层(必要时可重新混匀)。
4. 室温下5000rpm离心5分钟。
5. 仔细移取上清液至另一50ml离心管,加入1倍体积异丙醇,混匀,室温下放置片刻即出现絮状DNA沉淀。
6. 在1.5mleppendorf中加入1ml TE。用钩状玻璃棒捞出DNA絮团,在干净吸水纸上吸干,转入含TE的离心管中,DNA很快溶解于TE。
7. 如DNA不形成絮状沉淀,则可用5000rpm离心5分钟, 再将沉淀移入TE管中。这样收集的沉淀,往往难溶解于TE,可在60℃水浴放置15分钟以上,以帮助溶解。
8. 将DNA溶液3000rpm离心5分钟,上清液倒入干净的5ml离心管。
9. 加入5μlRNaseA(10μg/μl), 37℃ 10分钟, 除去RNA(RNA对DNA的操作、分析一般无影响,可省略该步骤)。
10. 加入1/10体积的3mol/L NaAc及2×体积的冰乙醇,混匀,-20℃放置20分钟左右,DNA形成絮状沉淀。
11. 用玻棒捞出DNA沉淀,70%乙醇漂洗,再在干净吸水纸上吸干。
12. 将DNA重溶解于1ml TE, -20贮存。
13. 取2μlDNA样品在0.7% Agarose胶上电泳, 检测DNA的分子大小。同时取15μl稀释20倍, 测定OD260/OD280, 检测DNA含量及质量。
方法三:
植物DNA的SDS提取法:
试验试剂:
1、研磨缓冲液:称取59.63gNaCl,13.25g柠檬酸三钠,37.2gEDTA-Na分别溶解后合并为一,用0.2mol/L的NaOH调至pH7.0,并定容至1000ml。
2、10×SSC溶液:称取87.66gNaCl和44.12g柠檬酸三钠,分别溶解,一起定容至1000ml。
3、1×SSC溶液:用10×SSC溶液稀释10倍。
4、0.1×SSC溶液:用1×SSC溶液稀释10倍。
5、Rnase溶液:用0.14mol/LNaCl溶液配制成25mg/ml的酶液,用1mol/LHCl,pH至5.0,使用前经80℃水浴处理5min(以破坏可能存在的Dnase)。
6、氯仿-异戊醇:按24ml氯仿和1ml异戊醇混合。
7、5mol/L高氯酸钠溶液:称取NaClO4·H2O 70.23g,先加入少量蒸馏水溶解再容至100ml。
8、SDS(十二烷基硫酸钠)化学试剂的重结晶:将SDS放入无水酒精中达到饱和为止,然后在70~80℃的水浴中溶解,趁热过滤,冷却之后即将滤液放入冰箱,待结晶出现再置室温下凉干待用。
9、1mol/LHCl。
10、0.2mol/LNaOH。
11、二苯胺乙醛试剂:1.5g二苯胺溶于100ml冰醋酸中,添加1.5ml浓硫酸,装入棕色瓶,贮存暗处,使用时加0.1ml乙醛液〔浓乙醛:H2O=1:50(V/V)〕。
12、1.0mol/L高酸溶液(HClO4)。
13、0.05mol/LNaOH。
14、DNA标准液:取标准DNA25mg溶于少量0.05mol.L-1NaOH中,再用0.05mol/LNaOH定容至25ml,后用移溶管吸取此液5ml至50ml容量瓶中,加5.0ml1mol/LHClO4,混合冷却后用0.5mol/LHClO4定容至刻度,则得100μg/ml的标准溶液。
实验步骤:
1、称取植物幼嫩组织10g剪碎置研钵中,加10ml预冷研磨缓冲液并加入0.1g左右的SDS,置冰浴上研磨成糊状。
2、将匀浆无损转入25ml刻度试管中加入等体积的氯仿-异戊醇混合液,加上塞子,剧烈振荡30s,转入离心管,静置片刻以脱除组织蛋白质。以4000rpm离心5min。
3、离心形成三层,小心地吸取上层清液至刻度试管中,弃去中间层的细胞碎片、变性蛋白质及下层的氯仿。
4、将试管置72℃水浴中保温3min(不超过4min),以灭活组织的DNA酶,然后迅速取出试管置冰水浴中冷却到室温,加5mol/L高氯酸钠溶液〔提取液:高氯酸钠溶液=4:1(V/V)〕,使溶液中高氯酸钠的最终浓度为1mol/L。
5、再次加入等体积氯仿-异戊醇混合液至大试管中,振荡1min,静置后在室温下离心(4000rpm)5min,取上清液置小烧杯中。
6、用滴管吸95%的预冷乙醇,慢慢地加入烧杯中上清液的表面上,直至乙醇的体积为上清液的两倍,用玻璃棒轻轻搅动。此时核酸迅速以纤维状沉淀缠绕在玻璃棒上。
7、然后加入0.5ml左右的10×SSC,使最终浓度为1×SSC。
8、重复第6步骤和第7步骤即得到DNA的粗制品。
9、加入已处理的Rnase溶液,使其最后的作用浓度为50~70μg/ml,并在37℃水浴中保温30min,以除去RNA。
10、加入等体积的氯仿-异戊醇混合液,在三角瓶中振荡1min,再除去残留蛋白质及所加Rnase蛋白,室温下以4000rpm离心5min,收集上层水溶液。
11、再按6、7步骤处理即可得到纯化的DNA液。
方法四:
改进的SDS法提取植物叶片基因组DNA
1、取指甲大小的植物叶片,置于研钵中,加入适量液氮,用研棒磨成粉未(越细越好)。
2、将粉末移入1.5 ml离心管,加入DNA提取洗涤液1.5 ml,轻轻颠倒混匀。
3、8000 rpm离心10 min,弃上清,加入洗涤液1 ml,混匀,8000 rpm离心10min,弃上清,共洗涤2遍。
4、加入预热的DNA裂解液500 μL,用牙签轻轻搅拌均匀,置65℃水浴30 min。
5、水浴后立即加入苯酚/氯仿/异戊醇500 μL,颠倒数次,这时溶液变为乳白色,10000 rpm离心5min,取上清液至新的1.5ml离心管中。
6、加入55 μL醋酸钾,颠倒混匀,10000 rpm离心10min,取上层清液转移至新的1.5ml离心管中。
7、加入异丙醇300 μL,室温30 min或-20℃放置2 hr,12000 rpm离心10min,弃上清,取沉淀,加入500μL70%乙醇,室温放置2 min,12000 rpm离心5 min,弃上清,取沉淀。
8、加入30 μL含5 g/ml RNase 的TE缓冲液,37℃水浴放置1hr。
9、离心30 s后,取10 μL于0.8%琼脂糖凝胶上进行电泳鉴定。
方法五:
植物DNA的CTAB提取法:
1、称取新鲜叶片2-3g,剪碎放入研钵中,在液氮中研磨成粉末。
2、将粉末转移到加有7ml经预热的15×CTAB提取缓冲液15ml离心管中,迅速混匀后置于65℃水浴中,温育30min。
3、取出离心管,冷却至室温,加入氯仿/异戊醇(24:1),充分混匀,室温下2300转离心20min。
4、将上清转移至另一新的15ml离心管中,加入1/10体积10%的CTAB和等体积的氯仿/异戊醇。充分混匀,2300rpm离心20min。
5、转移上清至另一新的15ml离心管中,加入等体积1%的CTAB沉淀缓冲液,轻轻摇晃至形成DNA絮状沉淀。1000rpm离心10min,使DNA沉淀于管底。
6、加入1.5-2ml的1mol/LNaCl及5μlRNase置于56℃水浴中过夜。
7、待DNA完全溶解后,加2-3ml4℃预冷的95%的冰乙醇使DNA沉淀,挑出DNA,置于15ml离心管中,用70%乙醇清洗30min。
8、离心机甩5s,倒出70%乙醇,再用95%乙醇浸泡5min,倒出95%乙醇,在超净工作台上吹干。
9、将风干的DNA直接在4℃保存备用或溶于100μlTE溶液中于-20℃保存。