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前段时间为了扩展物种源性鉴定试剂盒的种类，决定增加马源和驴源的鉴定试剂盒。在研发阶段遇到了一些意想不到的事情，今天小新来和大家分享一下。
物种源性鉴定试剂盒采用TaqMan实时荧光PCR技术，根据各物种间基因序列差异而进行动物源性成分鉴定。本次马和驴的特异性引物及探针是采用了《SB/T 10923-2012 肉及肉制品中猪、牛、羊、马、驴、鸡、鸭、鹅、兔源性成分的快速鉴定 实时PCR法》，具体序列如下：
马源性成分检测用引物（对）序列为：
FP：5′- CCAATGCGTATTCTGACTCTTAGTG -3′
RP：5′- CGATAATTACGTATGGGTGTTCC -3′
Pro：5′ FAM- CTGACACTAACATGAATCGGCGGACAGC-TAMRA 3′
驴源性成分检测用引物（对）序列为：
FP：5′- CCTCAGCACTCCCCCTCAT -3′
RP：5′- AAGGATAAGGGCTAATACACCA -3′
Pro：5′ FAM- CCAGAATGGTATTTCCTATTTGCTTACGCC-TAMRA3
引物和探针搞定后，接下来就是DNA了，为此小新专门在淘宝上购买了一份马肉和一份驴肉，然后用Simgen动物组织DNA试剂盒（Cat.No.3101050）分别提取马肉和驴肉的DNA。
最后就是PCR扩增测试了，在配置扩增试剂的时候，小新突然想到网上说的驴肉频繁造假事情，再加上买的驴肉居然比马肉还便宜，心里有些不踏实，于是决定验证一番。扩增曲线如下：
1是阴性对照 2、3是提取的马肉DNA，4是提取的驴肉DNA 5-8是用的驴特异性引物探针 5是阴性对照 6、7是提取的驴肉DNA 8是提取的马肉DNA1-4是用的马特异性引物探针，
购买的马肉看来是真的，扩增结果无异常。但是驴肉确实是假的，这个所谓的驴肉不能用驴的特异性引物探针扩增出来，但可以用马的特异性引物探针扩增出来，只能说明这是马肉造假的驴肉。
于是小新又换了一家淘宝店购买驴肉，并和店家沟通了一番。在了解到小新是为了做物种检测后，商家大方的送了一根带点肉的驴骨做检测用。用骨头上带着的驴肉提取了DNA并进行了PCR扩增，结果如下：
1是阴性对照 2、3是提取的马肉DNA 4是新提取的驴肉DNA 5-7是用的驴特异性引物探针 5是阴性对照 6、7是新提取的驴肉DNA1-4是用的马特异性引物探针
结果显示新提取的驴肉DNA不仅能用驴的特异性引物探针扩增出来，同时也可以用马的特异性引物探针扩增出来，不过扩增效率要差一些。
小新与小伙伴们对于这一结果经过多番探讨，觉得有两种可能：
1．怀疑驴肉上沾染到了马的DNA。于是敲开驴骨，提取了3管骨髓的DNA进行PCR。扩增结果如下：
1是阴性对照 2是提取的马肉DNA 3、4是提取的驴骨髓DNA 5-8是用的驴特异性引物探针 5是阴性对照 6、7、8是提取的驴骨髓DNA1-4是用的马特异性引物探针
结果显示驴骨髓DNA仍旧能用马的引物探针扩增出来，这说明不是样本的问题。
2．怀疑马的引物有问题。于是专门去NCBI上Blast，发现确实有点问题，用马的引物进行Primer-BLAST时，查找生物选择驴（Equus asinus），最后居然也找到了对应的序列，当然其中有个别碱基不同，这应该就是为什么扩增效率低的原因吧。之后小新又重新合成了一组新的引物探针，这次采用的是《SNT 3730.5-2013 食品及饲料中常见畜类品种的鉴定方法 第5部分：马成分检测 实时荧光PCR法》中的引物探针序列，并且上NCBI又核对了一遍，确认没有问题。最后扩增结果如下：
结果证实确实是引物探针存在问题。
总结
1. 马和驴都是属于脊索动物门、脊椎动物亚门、哺乳纲、奇蹄目、马科、马属，只有种不一样，亲缘关系比较近，导致两者间的基因有很多相同或者类似的，因此设计引物时需要多加注意。我们的实验证明了《SNT 3730.5-2013 食品及饲料中常见畜类品种的鉴定方法 第5部分：马成分检测 实时荧光PCR法》中设计的马引物探针序列比较靠谱，《SB/T 10923-2012 肉及肉制品中猪、牛、羊、马、驴、鸡、鸭、鹅、兔源性成分的快速鉴定 实时PCR法》中的马引物探针设计有缺陷，建议不要采用。
2. 造假情况比我们想象的还要接近我们的生活，就像这次买的“驴肉”，当时还是挑选的一家销量不错的店，没想到还是被骗了。由于卖家对我们这种专业做物种源性检测的用户还拒不认错，我们决定曝光一下这家淘宝天猫店——味健旺旗舰店，提醒大家不要上当受骗。
3. 这次实验可谓是一波三折，不仅买的样品出现造假情况，就连非常严肃的参考资料都可能有漏洞。这就提醒我们不能盲目相信网上的各种信息，科学地设计实验，细心地验证，才是最有保障的获取知识的方法。
备注：实验所采用的一些仪器、设备、试剂如下
试剂：
动物组织DNA试剂盒（Simgen，Cat.No.3101050）
2×Probe qPCR Mix（Simgen，Cat.No.7206100）
仪器：
超微量电子天平（DENVER INSTRUMENT，TP-213）
旋涡震荡器（越新仪器，XH-C）
台式离心机（eppendorf Centrifuge 5415 D）
超微量分光光度计（Simgen Cat.No.sim100）
荧光定量PCR仪（ABI7500）
