冬季提取质粒DNA减少RNA污染的懒人策略

冬季一到，陆续又接到几个用户反映Simgen快速质粒DNA小量试剂盒提取的质粒DNA存在RNA污染。小新查看用户的投诉记录，发现了几个特点：1.以往的年份也有客户投诉过相同的问题。2. 投诉率不高，似乎只有某些实验室有投诉。3.投诉总是发生在冬季，夏季则从来没有投诉过。以上种种迹象表明试剂盒本身可能不存在问题，诱导的因素是温度，所以小新猜测应该是温度降低导致RNase A活性降低这一可能性最大。为了验证猜测，小新设计了模拟冬夏季温度条件下进行质粒DNA提取的实验。

一、实验目的：

试剂盒使用的环境温度对RNaseA活性的影响。

二、实验材料：

含质粒的细菌过夜培养物

快速质粒DNA小量试剂盒（Simgen，Cat.No. 1005050）

电子恒温水浴锅（上海宜昌仪器纱筛厂）

冰箱（Haier，BCD-130H）

台式离心机（eppendorf Centrifuge 5415 D）

旋涡震荡器（越新仪器，XH-C）

超微量分光光度计（Simgen Cat.No.sim100）

电泳仪（北京六一仪器厂，DYY-6C型） 

三、实验方法：

取一盒快速质粒DNA小量试剂盒，加好RNase A和无水乙醇，将除了BufferⅡ外的所有试剂都分成两份，其中一份放到37℃的水浴锅中，模拟夏天的温度；另一份放到4℃冰箱，模拟冬天室温。BufferⅡ放在37℃的水浴锅中（因为BufferⅡ低温易结晶，冬季也会先放在37℃水浴）。

为了更容易观察到RNA污染的效果，小新特别用了最大量（5 ml）的细菌培养物，分别用这两份不同温度存放的试剂提取质粒DNA，实验步骤如下：

1. 12000 rpm离心30秒收集 5 ml 过夜培养的细菌，弃尽培养基。加入 250 μl已加入 RNase A 的 Buffer I。

2. 加入250 μl Buffer II ，温和并充分地翻转离心管 4-6次。

3. 加入 350 μl Buffer N8，温和并充分地翻转离心管直至溶液中残留的蓝色沉淀全部消失，转变为淡黄色沉淀。

4. 最高速（≧12000 rpm）离心 2 分钟。

5. 将核酸纯化柱置于 2 ml 离心管中，将步骤 4 中的上清液倒入核酸纯化柱中，盖上管盖，12000 rpm离心 30秒。

6. 弃 2 ml离心管中的滤液，将核酸纯化柱置回到 2 ml离心管中，在核酸纯化柱中加入800 μl Buffer W2,  盖上管盖，12000 rpm离心30秒 。

7. 弃 2 ml离心管中的滤液，将核酸纯化柱置回到 2 ml离心管中，最高速（≧12000 rpm）离心1分钟。

8. 弃 2 ml离心管，将核酸纯化柱置于一个洁净的 1.5 ml离心管中，在纯化柱的膜中央加入60 μl Buffer E ，盖上管盖，室温静置1分钟，12000 rpm离心30秒。

9. 弃纯化柱，得到质粒DNA。

四、实验结果：

1. 在超微量分光光度计上用试剂盒的Buffer E调零，测量洗脱下来的DNA，结果如下：（表一）

样品名称	Abs260	Abs280	Abs230	260/230	260/280	浓度ng/μl
4℃	11.679	5.788	5.581	2.09	2.02	583.9508
4℃	11.560	5.710	5.516	2.10	2.02	577.9800
4℃	9.761	4.839	4.518	2.16	2.02	488.0405
4℃	9.987	4.887	4.735	2.11	2.04	499.3611
37℃	5.280	2.668	2.529	2.09	1.98	263.9873
37℃	5.181	2.617	2.484	2.09	1.98	259.0307
37℃	5.254	2.644	2.522	2.08	1.99	262.6758
37℃	4.875	2.439	2.312	2.11	2.00	243.7359

2. 在1%的琼脂糖凝胶上，加入8 μl（加大上样电泳体积的目的是便于观察残留的RNA）洗脱的DNA，电泳5分钟（注意如果电泳时间太长，残留的RNA也会因弥撒而观察不到的），结果如下：

1. 从表一和图一可知，放置在4℃的试剂提取出来的质粒DNA中RNA含量明显比放置在37℃的试剂提取出来的质粒DNA中RNA含量多，验证了低温环境下快速质粒DNA小量试剂盒提取的质粒DNA中RNA污染会比较严重这一现象。

2. 从图二中可以看到，上午和下午提取的质粒DNA中的RNA残留情况虽然肉眼对比差异不明显，但是对比表一和表二的数据就可以发现，下午提取的质粒DNA的Abs_260/280比上午提取的要小一些，浓度也低一些，说明下午提取的质粒DNA中RNA残留情况要低于上午提取的质粒DNA。

3. 尽管小新用37℃温育后的Buffer I、Buffer II、Buffer N8来模拟夏天的条件，但需要注意的一点是，环境温度仍然是不满足夏天条件的（比如离心管的温度、吸头的温度，离心机的温度等等），这应该是37℃温育试剂提取质粒DNA仍然残留有少量RNA的主要原因。

大家都知道RNA酶很皮实，耐高温，但是再怎么样终归还是酶，最适温度就是37℃（Simgen 质粒试剂盒中的RNA酶来自牛胰，牛的正常体温是38℃～39.5℃，所以最适温度可能还要再高一点）左右，一到冬季自然大打折扣。既然小新的实验验证了冬季RNase A活性降低是质粒提取试剂盒被投诉的主要原因，那小新就可以开始对症下药了：

1. 冬天提取质粒DNA的时候，直接把快速质粒DNA小量试剂盒放到恒温箱里温育（反正Buffer II冬天会结晶，就是需要提前温育的）到37℃后再使用。

2. 把实验室的空调开高一些，等温度升高后再做实验（记得有一年实验室一直不能重复出用户投诉的RNA污染结果，现在怀疑和空调温度打得太高了也有一定的关系）。

3. 不要急着做实验，把养好的细菌凉一凉再做（等个4~5个小时，因为细菌在不良的生长环境下会减少新陈代谢，RNA会自行降解掉一部分）。

4. 减少细菌的用量，RNA酶需要消化的RNA总量就减少了。

5. 最后一招，如果不缺钱，干脆再采购一支RNase A加到Buffer I中，那效果也是立竿见影的。

以上的解决方案中1~4条都是偷懒的行为，说明在了解事物本质的前提下，适当地偷懒反而能达到事半功倍的效果。