如何提取酵母RNA --实测高多糖多酚植物总RNA试剂盒

前几天，有个客户询问如何提取酵母的RNA，小新当时就推荐了超纯总RNA提取试剂盒，这个试剂盒的说明书中就有酵母的提取步骤。之后考虑到通用性极强的高多糖多酚植物总RNA试剂盒是不是效果会更好呢，于是决定实际测试一下。

一、实验目的：

比较高多糖多酚植物总RNA试剂盒与超纯总RNA提取试剂盒提取酵母RNA的效果。

二、实验材料：

新鲜培养的酵母、研钵、高多糖多酚植物总RNA试剂盒（Simgen Cat.No.5103050）、超纯总RNA提取试剂盒（Simgen Cat.No.5003050）

超微量电子天平（DENVER INSTRUMENT，TP-213）

旋涡震荡器（越新仪器，XH-C）

台式离心机（eppendorf Centrifuge 5415 D）

超微量分光光度计（Simgen Cat.No.sim100）

电泳仪（北京六一仪器厂，DYY-6C型）

三、实验内容：

超纯总RNA提取试剂盒提取方法：

1. 将培养的酵母菌离心沉淀弃上清液，震荡悬浮，用移液枪吸取300 mg于研钵中，加入3 ml Buffer TL进行研磨。充分研磨后，吸取2管1.1 ml液体于1.5 ml离心管中。

2. 加入200 μl Buffer EX，旋涡震荡混匀，12000 rpm离心。

3. 吸取600 μl上层水相于新的1.5 ml离心管中，加入同体积70%乙醇，混匀后分两次加入核酸纯化柱中，离心弃滤液。

4. 在核酸纯化柱中依次加入500 μl Buffer WA和600 μl Buffer WBR洗涤。

5. 14000 rpm空离1分钟去除残留乙醇。

6. 将核酸纯化柱放于RNase-Free的1.5 ml离心管中，加入50 μl RNase-Free Water，室温静置1分钟，离心洗脱得到酵母RNA。

高多糖多酚植物总RNA试剂盒提取方法：

1. 将培养的酵母菌离心沉淀弃上清液，震荡悬浮，用移液枪吸取300 mg于研钵中，加入1.8 ml已加入β-巯基乙醇的Buffer RCT进行研磨。充分研磨后，吸取2管700 μl液体于1.5 ml离心管中。

2. 加入600 μl Buffer EX，旋涡震荡混匀，12000 rpm离心。

3. 吸取350 μl上清液于新的1.5 ml离心管中，加入同体积Buffer K，混匀后转移到过滤柱过滤。

4. 在滤液中加入700 μl 70%乙醇，混匀后分两次加入核酸纯化柱中，离心弃滤液

5. 在核酸纯化柱中依次加入500 μl Buffer WA和600 μl Buffer WBR洗涤。

6. 14000 rpm空离1分钟去除残留乙醇。

7.将核酸纯化柱放于RNase-Free的1.5 ml离心管中，加入50 μl RNase-Free Water，室温静置1分钟，离心洗脱得到酵母RNA。

将提取到的RNA在超微量分光光度计上测量浓度和纯度，并进行琼脂糖凝胶RNA电泳检测。

四、实验结果：

1. 在超微量分光光度计上用RNase Free Water调零，测量洗脱下来的RNA，结果如下：

其中1、2为高多糖多酚植物总RNA试剂盒提取的酵母RNA结果，3、4为超纯总RNA提取试剂盒提取的酵母RNA结果。

2. 在1%的琼脂糖凝胶上，加入5 μl提取到的RNA，电泳25分钟，结果如下：

五、实验讨论与分析：

1. 从测得的浓度分析，高多糖多酚植物总RNA试剂盒提取到的RNA浓度稍高一点。再结合电泳分析，高多糖多酚植物总RNA试剂盒提取的RNA条带相对而言亮度更高，也更清晰，而超纯总RNA提取试剂盒提取到的RNA条带亮度则明显较暗。因此可以推断出超纯总RNA提取试剂盒提取到的RNA实际浓度可能比分光光度计测的数值更低，可能有较高比例的OD₂₆₀吸收值其实是由小片段RNA所贡献（见电泳图泳道4、5底部）。

2. 综上所述，虽然两种试剂盒都可从酵母中提出RNA，且浓度和纯度单纯从分光光度计上分析都还不错，但结合电泳分析，高多糖多酚植物总RNA试剂盒在提取酵母RNA上更胜一筹。

3. 之前的一篇文章（实测SIMGEN高多糖多酚植物总RNA试剂盒强大的通用性）中介绍过，针对那些高多糖多酚样本，需要使用高多糖多酚植物总RNA试剂盒，用超纯总RNA提取试剂盒提取往往会出现一些问题。而酵母细胞壁的主要成分是甘露聚糖和β-葡聚糖，这两者都属于多糖，占了细胞壁干重的60%，这可能是超纯总RNA提取试剂盒的提取效果不如高多糖多酚植物总RNA试剂盒的主要原因。延伸开来分析，一些丝状真菌的细胞壁中如果含较高多糖组分的，也应该选用高多糖多酚植物总RNA试剂盒提取RNA。