“酶：大多是蛋白质，但少数具有生物催化功能的分子并非为蛋白质，有一些被称为核酶的RNA分子也具有催化功能。此外，通过人工合成所谓人工酶也具有与酶类似的催化活性，包括人工合成的DNA。 有人认为酶应定义为具有催化功能的生物大分子，即生物催化剂……”边看书边打瞌睡的小新实在熬不住了，把书扔了，还是去实验室点小实验比较有意思。【千万不要学小新不爱读书，隔三差五要被领导教育QAQ】
实验室里围了一圈同事，原来是前几天新订的Taq酶到货了，可是拿到东西的大师兄在做实验的过程中犯了难。忍不住好奇的小新也把脑袋伸了过去。
原来是因为近期的技术服务需要做一个细菌16s的扩增，但是不同浓度的试验样本做出来的结果居然都是一样的，小新死皮赖脸的把这份不正常的结果拿来了，情况确实很糟糕：大师兄的试验采用梯度稀释的样本，分别由1稀释到10-6，但是从试验结果来看，各个样本的CT值均围绕在15-17之间，也就是说，从荧光结果上完全看不出任何样本差异啊！
引物序列：（F）TGTGTAGCGGTGAAATGCG
（R）TCGTTTACGGCGTGGAC 该段引物序列扩增产物片段长度为138bp
为了搞清楚为什么，小新开始重复大师兄的试验，出来的结果依旧如此，排除实验员操作的问题，那就是体系的原因了。正准备逐一排查到底是哪个实验成分有问题时，小新发现了对照组阴性【就是没有加入DNA模板的那组】居然和其他组的结果一样，那就说明是体系里混进去了其他的DNA模板，并且是细菌的DNA模板。由于换了新的Taq酶才开始出现这种结果，那么头号怀疑对象当然就是新的Taq酶咯。
问了一下师兄，现在的Taq酶是哪家公司的，师兄说是JL的，恰好小新手上还有一些其他公司的Taq酶，那就正好来个大检查，看看到底是哪家公司的Taq酶混进去的DNA最多，还是大家生产的酶都混进去了很多DNA。
试验过程倒是很简单，通过简单的阴性试验就能出来结果。
小新选取了四种不同公司的酶：1、莱枫，2、JL，3、康为，4、TaKaRa，采用引物序列依旧是16s的通用引物。在此基础上进行了全阴性试验。一个多小时的等待，实验结果终于出来了。
图中的荧光线从前往后所用的酶依次是：JL、康为、TaKaRa、莱枫
观察实验结果，根据CT值的分析，JL的CT值最为靠前，也就是说其含细菌DNA浓度最高，其余三家公司的Taq酶也都存在DNA残留。也就是说无论是哪家公司的Taq酶都无法做出真正意义上的阴性结果。那么这样的Taq酶对普通的16sPCR扩增是否也存在影响呢？好奇的小新进行了16s普通 PCR全阴性扩增，再对扩增产物进行电泳，出来的结果如图：
注：普通的16s 采用的引物序列为： F AGAGTTTGATCCTGGCTCAG
R GGCTACCTTGTTACGACTT
该段引物序列扩增产物片段长度为1497bp
从电泳图可以清晰的看出，JL、康为和TaKaRa公司产出Taq酶在进行阴性16s扩增时，也会出现隐约的条带当然，这并不排除环境中细菌DNA的污染。
结论：作为Taq酶生产厂家都会尽力设法去除残留的大肠杆菌基因组DNA。但是有Taq酶生产厂家曾表示，Taq酶由于本身就会结合一部分DNA，因此Taq酶残留的几百bp细菌DNA是无法彻底去的除，本次实验验证了该厂家的论述，同时也说明用扩增短片段的通用性16s细菌引物检测细菌数量是不可靠的，应当设计特异性的细菌引物检测细菌，才能使试验结果更具有说服性。好啦，这期的小新课堂结束了，我们下期再会！
