Simgen高多糖多酚植物总RNA试剂盒实测---闽楠叶片RNA的提取

某天跟客户闲聊的时候，客户突然提出了一个问题，“我们用T***gen的高多糖多酚试剂盒，通常洗脱体积30 μl，得到的RNA浓度也就100多ng/μl，到200 ng/μl的时候很少，做反转录总会觉得不够用，而且他们的试剂盒，研磨完加入裂解液，会变成特别粘稠的鼻涕状，吸上清的时候特别费劲”。

于是我们从客户那边要来了样本，带回公司进行了研究。那么是否是因为产品的不同而产生的差异呢？接下来就让我们通过实验来寻找答案吧。

一、实验目的

从闽楠叶片中提取RNA。

二、实验材料：

新鲜闽楠叶片

研钵

高多糖多酚植物总RNA试剂盒（Simgen,Cat.No. 5103050）

DNase Ⅰ柱上消化试剂盒（Simgen,Cat.No. 8010050）

三、实验方法

本次实验尝试用高多糖多酚植物总RNA试剂盒和DNase Ⅰ柱上消化试剂盒（Simgen,Cat.No. 8010050）提取闽楠叶片RNA。

高多糖多酚植物总RNA试剂盒中插入DNase Ⅰ柱上消化试剂盒操作提取步骤

1. 在研钵中称取200 mg植物组织，加入液氮，将组织研磨至粉末状，再用液氮预冷的1.5 ml离心管称取50 mg研磨成粉末状的组织。

* 研磨组织时应及时补加液氮，避免组织融化，以免内源性的RNA酶恢复活性而降解RNA。

2. 加入600 μl已加入β-巯基乙醇的Buffer RCT，旋涡振荡直至组织全部溶解。

3. 加入600 μl Buffer EX，用力混合均匀，12000 rpm离心5分钟。

4. 小心吸取350 μl上清液，转入一个洁净的1.5 ml离心管中。

5. 在上清液中加入350 μl Buffer K并直接用吸头吸注6-8次混合均匀，将混合液全部转移到过滤柱中，盖上管盖，13000 rpm离心1分钟。

6. 弃过滤柱，向滤液中加入700 μl 70％乙醇并直接用吸头吸注6-8次混合均匀，吸取700 μl混合液加入到核酸纯化柱中，盖上管盖，13000 rpm离心1分钟。

7. 弃2 ml离心管中的滤液，将核酸纯化柱置回到2 ml离心管中，吸取剩余的混合液加入到核酸纯化柱中，13000 rpm离心1分钟。

8. 弃2 ml离心管中的滤液，将核酸纯化柱置回到2 ml离心管中，在核酸纯化柱中加入500 μl Buffer WA，盖上管盖，13000 rpm离心1分钟。

9. 每个反应取5 μl DnaseⅠ、45 μl Buffer RDD配制柱上消化孵育液，勿弃吸头，直接用移液器温和地吹打几次混合均匀。

10. 弃2 ml离心管中的滤液，将核酸纯化柱置回到2 ml离心管中，向吸附柱中央加入50 μl步骤9配好的孵育液，室温(20-30℃)放置15 min。

11. 加入500 μl Buffer WA，盖上管盖，12000 rpm离心30秒。

12. 弃2 ml离心管中的滤液，将核酸纯化柱置回到2 ml离心管中，在核酸纯化柱中加入600 μl Buffer WBR，盖上管盖，13000 rpm离心1分钟。

13. 弃2 ml离心管中的滤液，将核酸纯化柱置回到2 ml离心管中，14000 rpm离心1分钟。

14. 弃2 ml离心管，将核酸纯化柱置于一个洁净的RNase-free的1.5 ml离心管中，在纯化柱的膜中央加入50 μl RNase-free Water，盖上管盖，室温静置1分钟，13000 rpm离心1分钟。

15. 弃纯化柱，洗脱的RNA可立即用于各种分子生物学实验；或者将RNA储存于﹣70℃以下备用。

四、实验结果：

                                                       样本1、2、3均来自同一株闽楠

2. 在1%的琼脂糖凝胶上，加入5 μl提取到的RNA，电泳20 min，结果如下：

五、讨论与分析：

从结果上分析，Simgen高多糖多酚总RNA试剂盒能提取到闽楠叶片RNA，且RNA的得率相对T***gen产品有显著提高。

客户提出的“闽楠叶片经过液氮研磨加入裂解液后会变得十分粘稠，像鼻涕状，难以吸取上清”，这是由于闽楠叶片中含有较多的多糖（特别是淀粉类物质）衍生物的干扰，也证明了T***gen产品对于闽楠这一样本RNA提取的局限性。

闽楠叶片由于纤维化较严重，且本身RNA的含量就相对较低，而Simgen高多糖多酚总RNA试剂盒操作步骤较为简单，不存在上清吸不上来的问题，且RNA提取得率较高，完美适应闽楠叶片RNA的提取。这时候选用Simgen高多糖多酚总RNA试剂盒提取RNA确实是省时省力的好办法。