实验耗材DNase、RNase、细菌内毒素的检测方法

作者:新景实验室
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分子生物学实验过程中会需要用到各种各样的耗材,比如离心管、移液器吸头、各类试剂瓶和冻存管等,有些实验对耗材的要求比较高,比如RNA实验中会要求耗材必须是RNase-free的,细胞转染实验中会要求耗材是无细菌内毒素的。

小新之前购买滤芯吸头的时候咨询过几个厂家,当问到吸头是否是DNase-free/RNase-free时他们都会说是的,但是当问到他们有没有检测过、是否有COA时,这几个厂家要么就直接说没有,要么就直接不说话了。这是因为很多耗材生产厂家并不具备这方面的相关知识,没有这方面的意识;也有一部分厂家虽然了解这方面的知识,也在生产过程中进行了控制,保证生产的耗材是DNase-free/RNase-free的,但是却缺少检测手段或检测条件,无法让客户信任。

正好前段时间有个耗材厂家找到我们,想让我们帮忙检测他们生产的耗材是否有DNaseRNase、细菌内毒素残留,今天小新就把检测的方法分享给大家。

 

一、检测材料

待测吸头、待测容器

无酶无内毒素吸头及耗材:1 ml滤芯吸头AxygenTF-1000-R-S),200 μl滤芯吸头AxygenTF-200-R-S),10 μl滤芯吸头AxygenTF-300-R-S),1.5 ml离心管AxygenMCT-150-C

DL2000 LadderSimgen Cat.No.MD1006

DNA纯化试剂盒(Simgen Cat.No.2101050

DNase ⅠSimgen Cat.No.8003050

6×Loading BufferSimgen Cat.No.9008005

ddH2O

Carrier RNA干粉,Simgen Cat.No.4003201

RNase ASimgen Cat.No.8001001

DEPC处理ddH2O

无内毒素水(细菌内毒素检查用水)

细菌内毒素(15 EU

鲎试剂(快速凝胶法λ=0.25 EU/mL

电热恒温培养箱(DNP-9082,上海精宏实验设备有限公司)

电泳仪(北京六一仪器厂,DYY-6C型)

 

二、检测方法

(一)DNase检测

1. 配置1%琼脂糖凝胶待用;

2. DL2000 LadderDNA纯化试剂盒清洁回收,去除DNaseⅠ消化抑制物

3. 设置阳性对照2组,阴性对照2组,测试样本n组(在确定无酶的离心管中配制):

阳性:8份清洁后的DL2000 Ladder+110×DNase Buffer +1DNaseⅠ;

阴性:8份清洁后的DL2000 Ladder+110×DNase Buffer +1ddH2O

测试样品:8份清洁后的DL2000 Ladder+110×DNase Buffer +1ddH2O

4. 测试吸头类:用待测吸头吹吸步骤3中的测试样品组溶液10次混匀;

测试容器类:在待测容器里加入步骤3中的测试样品组溶液,使用配套设备(盖子、封口膜等)密封,振荡混匀15 s后静置1 min,离心1000 rpm 10 s

5. 3组反应液放置37℃消化1 h

6. 加入6×Loading Buffer,电泳30 min

 

(二)RNase检测

1. DEPC处理ddH2O配置1%琼脂糖凝胶待用;

2. 1.5 ml DEPC处理ddH2O溶解干粉Carrier RNA,浓度大约206 ng/μL

3. 设置阳性对照2组、阴性对照2组、测试样本n(在确定无酶的离心管中配制):

阳性:1 RNase A+9Carrier RNA

阴性:1 DEPC处理ddH2O+9Carrier RNA

测试样品1DEPC处理ddH2O+9Carrier RNA

4. 测试吸头类:用待测吸头分别吹吸步骤3中的测试样品组溶液10次混匀;

测试容器类:在待测容器里加入步骤3中的测试样品组溶液,使用配套设备(盖子、封口膜等)密封,振荡混匀15 s后静置1 min,离心1000 rpm 10 s

5. 3组反应液放置37℃消化30 min

6. 加入6×Loading Buffer,电泳15 min

 

(三)内毒素检测

1. 细菌内毒素每瓶加1 ml无内毒素水溶解,振荡混匀15 min,然后用无内毒素水稀释到1 EU/ml,振荡混匀15 s备用(4可保存4小时);

2. 测试吸头类:吸取适量无内毒素水于明确无内毒素的离心管中,用待测吸头吹吸10次混匀得到提取液,吸取或合并提取液至100 μl进行测试,10 min内使用;

测试容器类:容器里加入适量无内毒素水(10-100 μl,不宜过多),使用配套设备(盖子、封口膜等)密封,振荡混匀15 s后得到提取液,吸取或合并提取液至100μl进行测试;

3. 向鲎试剂安瓿瓶中加100 μl无内毒素水,轻轻振荡使鲎试剂完全溶解(注意不要产生气泡,即用即配),按下列分组进行测试:

阳性:取2支鲎试剂加入100 μl步骤1的细菌内毒素;

阴性:取1支鲎试剂加入100 μl无内毒素水;

测试样品:取n支鲎试剂加入100 μl步骤2的提取液;

4. 封口后放入恒温箱37℃静置60 min±2 min,避免振动;

5. 静置完毕后,轻轻取出鲎试剂,缓慢倒转180°,判断是否有内毒素残留。

 

三、结果判定

1. DNase检测电泳结果如下:


若如图一所示,阴性对照及检测样品DNA条带清晰,亮度相同,阳性对照无DNA条带,则说明检测的样品是DNase-free的。

 

2. RNase检测电泳结果如下:


如图二所示,阴性对照及检测样品RNA条带清晰,亮度相同;阳性对照无RNA条带,说明检测的样品是RNase-free的。

3. 内毒素检测结果如下:

+:内容物呈坚实凝胶,不变形不从管壁滑脱;

-:不呈凝胶或虽生成凝胶但不能保持完整并从管壁滑脱。

阳性为+”,阴性和检测样品为“-”,说明检测的样品无内毒素或内毒素低于检出下限。

 

如果小伙伴们在实验过程中出现问题,怀疑是使用耗材所导致的,可以参考小新的方法对耗材进行检测,或者直接从有检测报告或者COA的厂家采购耗材。  



 




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