前段时间，有个客户投诉说用快速质粒DNA小量试剂盒提取的质粒DNA浓度低，询问他细菌用量的时候，客户说出一个令人震惊的用量——20 ml，明明试剂盒说明书中标明的用量是1-5 ml，为什么要使用那么多的细菌呢？客户回复说师兄师姐都是这么做的，她也就这么做了，而且之前师兄师姐做也没出问题。为了探究加大菌液用量会有什么影响，小新专门进行了以下测试。
一、实验目的：
测试用快速质粒DNA小量试剂盒分别提取5 ml、10 ml、15 ml和20 ml细菌时的效果。
二、实验仪器及试剂：
仪器：旋涡震荡器（越新仪器，XH-C）
台式离心机（eppendorf Centrifuge 5415 D）
超微量分光光度计（Simgen Cat.No.sim100）
电泳仪（北京六一仪器厂，DYY-6C型）
试剂：快速质粒DNA小量试剂盒（Simgen,Cat.NO.1005050）
三、实验方法：
考虑到接种量、培养时间、培养基体积的不同，最终细菌浓度也会有差别，因此本次实验进行了两次测试，分别测试低浓度和高浓度的细菌。具体操作如下：
1. 用50 ml离心管分别收集过夜培养的细菌5 ml，10 ml，15 ml，20 ml各两管，弃尽培养基。加入250 μl已加入RNase A 的Buffer I，充分悬浮沉淀的细菌。
2. 把悬浮液转移到1.5 ml离心管，加入250 μl Buffer II，温和并充分地翻转离心管4-6次。
3. 加入350 μl Buffer N8，温和并充分地翻转离心管直至溶液中残留的蓝色沉淀全部消失，转变为淡黄色沉淀。
4. 最高速（≧12000 rpm）离心2分钟。
5. 将核酸纯化柱置于2 ml离心管中，将步骤4中的上清液倒入核酸纯化柱中，盖上管盖，12000 rpm离心30秒。
6. 弃2 ml离心管中的滤液，将核酸纯化柱置回到2 ml离心管中，在核酸纯化柱中加入800 μl Buffer W2，盖上管盖，12000 rpm离心30秒。
7. 弃2 ml离心管中的滤液，将核酸纯化柱置回到2 ml离心管中，最高速 （≧12000 rpm）离心1分钟。
8. 弃2 ml离心管，将核酸纯化柱置于一个洁净的1.5 ml离心管中，在纯化柱的膜中央加入100 μl Buffer E，盖上管盖，室温静置1分钟，12000 rpm离心30秒。
9. 弃纯化柱，得到质粒DNA。
四、实验结果：
1. 在超微量分光光度计上用Buffer E调零，取2 μl洗脱的质粒DNA检测，记录各个波长的吸光度，得到的数据如下：
2. 在1%琼脂糖凝胶上，取5 μl质粒DNA进行电泳，结果如下：
3. 加入Buffer N8充分中和并离心后的现象如下图：在1%琼脂糖凝胶上，取5 μl质粒DNA进行电泳，结果如下：
五、分析与讨论：
1. 结合表一和图一分析可知，当细菌浓度较低时，细菌用量在5 ml、10 ml、15 ml时，随着细菌用量的增加，提取的质粒DNA确实增加了，同时残留的RNA也相应的增加了。但是当细菌用量到达20 ml时，提取的质粒DNA反而比15 ml时要少。说明细菌浓度较低时，增加细菌用量，能相应获得更多的质粒DNA，但是细菌用量超出一定范围后，质粒DNA的提取效率反而降低。
2. 结合表二和图二分析可知，不管是10 ml细菌，还是15 ml、20 ml细菌，提取到的质粒DNA均没有5 ml细菌多（注意：虽然从分光光度计上测得10 ml细菌提取到的质粒DNA浓度较5 ml细菌的更高，但是电泳并没有显示出更高的DNA浓度，所以应该是残留的RNA对数据造成了干扰）。说明细菌浓度较高时，超出5 ml的细菌用量就会降低最终的质粒DNA的提取效率了。
3. 其实只要我们稍微认真思考一下就会明白，关键因素是每次提取质粒DNA时细菌菌体的用量，而非细菌培养物的体积——因为不同的宿主菌、不同的培养基以及不同的细菌培养条件下每ml细菌培养物中的细菌数量会有很大的差异。那么问题来了，我们怎么确定自己是否使用了合适的细菌用量呢？首先，我们先要认真遵循说明书建议的细菌用量提取质粒DNA，操作至加入Buffer N8中和后离心2分钟，接着仔细观察沉淀的菌体碎片的沉积效果：如果菌体碎片沉积在底部形成一团致密的小块，比如图三的10 ml 和15 ml，以及图四的5 ml，都是比较合适的细菌用量；图三的5 ml中部分菌体碎片沉淀物贴在了管壁上，这是菌体用量过少的特征，可以适当增加菌体的用量。图三中的20 ml（右侧的那一管），图四中的10 ml、15 ml和20 ml，产生的菌体碎片沉淀蓬松，不致密，这都是菌体使用量过多的特征，必须减少菌体的用量。
4. 现在我们大致可以推测出为什么用户会用20 ml细菌提取质粒DNA了，或许她的师兄师姐养的细菌浓度较低，探索出增加细菌用量可以提高最后质粒DNA的浓度，于是就把这一方法教给了她，然而碰巧她用20 ml高浓度的细菌提取质粒DNA时，问题就产生了。事实上，后续用户听从我们的建议用5 ml菌液提取质粒DNA后，所投诉的问题也就迎刃而解了。
5. 如果从更深层次去分析原因，其本质上是细菌使用量过多时，溶解细菌的效率降低，不能被充分溶解破裂的细菌就不能充分释放质粒DNA，在中和步骤时大部分的质粒DNA仍然被包裹在菌体碎片、变性蛋白及基因组DNA所形成的沉淀物中，导致了质粒DNA回收效率过低。
本次实验说明了一点，在质粒DNA提取的过程中，用多少ml菌液提取质粒DNA确实是可变的，但是一味想着用提高菌液用量的方法来提高质粒DNA的浓度却会适得其反。当然只要我们培养的细菌每ml所含的质粒数量较多，我们就没必要老琢磨着用提高菌液用量的方法去获取更多的质粒DNA了，所以我们再引用一遍说明书中关于细菌培养的关键内容，希望同学们牢记于心：
(1) 不应吸取储存的甘油菌直接进行培养。长时间储存的甘油菌中的细菌可能已经出现细菌个体间基因型的变化，并混有丢失质粒的细菌。甘油菌必须在含有抗生素的平板上划线筛选，挑选生长良好的单菌落用于接种培养。
(2) 不要挑取多个单克隆菌落到一份液体培养基中培养。不同单克隆菌落间可能由于存在基因型差异的原因，相互间有生存竞争关系，反而使收获的菌量减少。
(3) 2-8℃冰箱中存放超过2周的平板中的菌落已经开始死亡，不再适合接种培养。
(4) 细菌培养时间不应超过16小时。培养时间超过16小时的细菌开始出现自溶现象，可能因此导致质粒DNA的得率降低。
(5) 用于细菌培养的培养基所占容器的体积不应大于1/4。
