血凝块DNA提取方法

作者:新景实验室
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方法一:

血凝块于室温下自然解冻后,取约1.0cm3的血凝块样本,加入适量生理盐水,浸泡15min6000r/min离心5min,弃上清。沉淀机械磨碎(勿过度),加入适量提取液(10mmol/LTris2HCL100mmol/LNaCl10mmol/LEDTA2%SDS)浸泡30min6000r/min离心5min,弃上清。沉淀中加消化液500μl(10mmol/LTris1mmol/LEDTA20g/LSDS300Lg/ml蛋白酶K)552h,其中每隔0.5h颠倒混匀一次,然后于37过夜。加等体积饱和酚,充分混匀,10000r/min离心5min;吸取上层水相,加等体积饱和酚:氯仿:异戊醇(25241);充分混匀,10000r/min离心5min;取上清加氯仿:异戊醇500μ1(241)10000r/min离心5min;取上清加1/10体积的NaAc(3mol/L),混匀,再沿管壁缓慢加入2倍体积的预冷无水乙醇,10000r/min离心5min,弃上清;用预冷75%乙醇洗涤,离心,弃上清,尽量将酒精吸干净,自然晾干(或真空抽干)50μl TE溶解(10mmol/LTris1mmol/LEDTA)。如有不溶物,用蛋白酶K处理后再溶解。-20保存

 

方法二:

35 ml 血块+ 5 ml 溶血试剂→入10 ml 匀浆管匀浆并用25 ml 溶血试剂洗至50 ml 离心管4 3000 r/ min 10 min →弃上清沉淀加20 ml 溶血试剂4 4 000 r/ min 10 min →弃上清沉淀加1. 5 ml 0. 5 % SDS 的核悬液轻洗至5 ml 离心管20 g/ ml的蛋白酶K10μl 37 水浴过夜→加等体积平衡酚混匀4 3 500 r/ min 10 min →小心吸去上层酚溶剂加等体积氯仿∶异戊醇(241)混匀4 3 500r/ min 10 min →轻轻吸取上清液至2 ml 离心管1/ 10 体积(0. 1 ml) 3 mol/ L NaAc 和等体积异丙醇轻轻颠倒几次可见有白色絮状物析出→8 000r/ min 2 min 弃上清分别加75 %和无水乙醇洗2次→弃乙醇液置真空干燥器内24 h 100μl TE缓冲液溶解DNA - 20 保存。

 

方法三:

1、解冻样品  -80冰箱中取出血样,在4冰箱中解冻,若其后仍有血凝块,加入适量生理盐水,浸泡15min,以3000r/min离心5min,弃上清液,取沉淀物

2、裂解红细胞  将样品置于15mL离心管内,窝旋混匀至血细胞悬起,加入10mL红细胞裂解液,上下颠倒离心管,4环境放置20min,其间上下颠倒3次,使红细胞完全裂解.在室温条件下,以2000r/min离心10min.弃掉上清液,取白色沉淀.用生理盐水洗涤沉淀,2000r/min离心5min,弃上清液.若洗涤后沉淀不是白色,可重复上述步骤,直到沉淀呈白色为止,红细胞裂解液可加至10.

裂解白细胞  用生理盐水洗涤白色沉淀,收集白细胞,窝旋混匀至白细胞悬起,加入3mL白细胞裂解液,吹打数次使沉淀分散,在37水浴中孵化(期间可吹打2次)1h,如孵化后仍有细胞团,可再加入1mL白细胞裂解液重复以上操作,直至溶液透明为止.

消化蛋白质  向每3mL样品中加入15μL蛋白酶K,上下颠倒25次,37孵化15min4条件下冷却,加入1mL饱和氯化钠溶液,窝旋混匀1020s(可见蛋白凝块),4冰箱中放置10min,在室温条件下以2000r/min离心10min,应于管底部出现沉淀,若没有或量少,可静置35min,再行离心.

5  DNA的抽提  将上清液移至内有3mL异丙醇的试管中,上下缓慢颠倒试管至DNA丝壮物形成,在室温条件下,以2000r/min离心2min,可见白色DNA沉淀.将上清液弃掉,加入700mL/L乙醇溶液3mL,上下颠倒数次,洗涤DNA沉淀及管壁,在室温条件下以2000r/min离心2min,可见白色DNA沉淀.弃掉上清液,加入1mL乙醇,混合均匀,置于离心管内,在4条件下以13000r/min离心5min,小心移去上清液,将离心管倒立在滤纸上,干燥至DNA团块呈半透明状为止.加入TE buffer 250μL65孵化1h,定时弹击试管壁使溶液混合均匀,在4条件下过夜,使DNA水合,分装于5个冷冻管内,于-20保存.

 

方法四:

碱性裂解法

取血凝块标本于室温条件下自然溶解,匀浆(可加适量生理盐水,也可不加),取0.5ml匀浆液(不同剂量标本其相应试剂用量按比例计算即可)于1.5ml Eppendorf管中;加入500μl 50mmol/l NaOH溶液,充分混匀后于60保温10min;然后加入50μl 1mol/L Tris-HCl溶液(pH8.0),充分混匀后4 12000r/min 离心10min;小心取上清与另一Eppendorf’管,加两倍体积预冷的无水乙醇,充分混匀后于4 12000r/min 离心10min;弃上清,在室温条件下干燥15min后加入100μl 1×TE buffer 充分溶解;最后将DNA溶液放置于-20冰箱备用,保存3个月以上则应放入-70冰箱。