植物RNA提取方法

作者:新景实验室
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异硫氰酸胍法 

1 g叶片液氮下充分研磨迅速转移至离心管加入3 mL 异硫氰酸胍提取液(4M异硫氰酸胍、2.5 M柠檬酸钠pH7.00.5 %十二烷基肌氨酸钠0.1 M巯基乙醇) 混匀。再依次加入0.3 mL 2 M NaAc (pH 4.0)3 mL水饱和酚和0.6 mL 氯仿/ 异戊醇(491) 混匀后冰浴15 min4 12 000 r/ min 离心20 min。上清液加入等体积苯酚/ 氯仿再次抽提离心上清液加入等体积异丙醇-20 沉淀RNA4 12000r/ min 离心10 min75 %乙醇洗涤两次100 %乙醇脱水。溶于100μl DEPC 重蒸水中。

 

尿素法 

1 g叶片加入过量液氮充分研磨快速转入离心管加入68倍体积的裂解缓冲液(7 M 尿素50 mM Tris-Cl pH8.010 mM Na2EDTA pH 8.03.5 M NaCl 6.25 %Tris 饱和酚pH 8.0 0.1 % SDS + 0.1 % LDS) 轻轻搅拌后0 冰浴20 min4 12000 r/ min离心15 min。上清液加1/ 3 体积3 M NaAc (pH5.3) 1/ 5 体积的氯仿/ 异戊醇(241)混匀后0 冰浴20 min4 12000 r/ min 离心15 min。上清液加入等体积冰浴冷却的异丙醇冰浴10 min4 5000 r/min 离心10 min。沉淀溶于5 mL 含有0.1 % SDS TE 缓冲液中加入8M LiCl 至终浓度2.5 M冰浴3 h 4 12000 r/min 离心10min75 %乙醇洗涤沉淀两次空气干燥后溶于DEPC 处理水中。

 

Tris - 硼酸法

离心管中加15 mL 提取缓冲(150 mMTris 50 mM EDTA 4 % SDS 硼酸调pH 7.5) 10μl 巯基乙醇加热到65 1 g叶片充分研磨后转移到离心管中混匀 65 1min。室温放置5 min。加1.5 mL 5 MKAc 4 mL乙醇涡旋。20 mL 氯仿/ 异戊醇( 241) 混匀后8000 r/min 离心20 min。上清液加入10 mL 苯酚和10 mL 氯仿/ 异戊醇10000 r/min 10 min。上清液中加入0.3 倍体积12 M LiCl 混匀 - 20 过夜。10000 r/min 1 min。沉淀溶于10 mL 3 MLi2Cl 10000 r/ min 10 min。沉淀溶于470μl DEPC 重蒸水30μl 5M KAc 等体积氯仿/ 异戊醇抽提10000 r/ min 5 min。上清液转入两倍体积的乙醇中- 20 沉淀RNA4 10 000r/ min 离心20 min。沉淀干燥后溶于100 μl DEPC 重蒸水中。