植物DNA提取方法

作者:新景实验室
版权说明:本文系原创文章 转载请标注出处和本文链接

方法一:

1.取两片幼嫩新鲜叶片,置于预冷的研钵中,倒入适量液氮,迅速研磨成粉末状,随后加入3ml预热的2%CTAB抽提缓冲液和50ul抗氧化剂2-巯基乙醇,继续研磨成略有流动性的糊状或粥状,转入1.5ml的离心管中,于65水浴锅中保温约60min

2.待混合物冷却至室温后加入等600ulCI(氯仿:异戊醇=241)溶液混匀,轻轻颠倒离心管几次使管内混合物成乳浊液,常温下10000rpm离心10min,取上清液转入另一干净的离心管中。 

3.重复步骤(2)一次。

4.取步骤(3)上清液加入2.5倍体积无水乙醇,仔细混匀,-20冰箱30min以上,沉淀DNA  412000rpm离心10min

5.弃去上层有机溶剂,加500ul75%乙醇洗涤沉淀,48000rpm离心5min,弃去上清,洗涤沉淀3次。 

6.倒置或者37度培养箱烘干。 

7.50ulTE缓冲液溶解DNA,于-20冷藏备用。

 

方法二:

1. 50ml离心管中加入20ml提取缓冲液Ⅰ, 60水浴预热。

2. 植物5-10g, 剪碎, 在研钵中加液氮磨成粉状后立即倒入预热的离心管中, 剧烈摇动混匀, 60水浴保温30-60分钟(时间长,DNA产量高), 不时摇动。

3. 加入20ml氯仿/戊醇/乙醇溶液颠倒混匀(需带手套, 防止损伤皮肤),室温下静置5-10分钟, 使水相和有机相分层(必要时可重新混匀)

4. 室温下5000rpm离心5分钟。

5. 仔细移取上清液至另一50ml离心管,加入1倍体积异丙醇,混匀,室温下放置片刻即出现絮状DNA沉淀。

6. 1.5mleppendorf中加入1ml TE。用钩状玻璃棒捞出DNA絮团,在干净吸水纸上吸干,转入含TE的离心管中,DNA很快溶解TE

7. DNA不形成絮状沉淀,则可用5000rpm离心5分钟, 再将沉淀移入TE管中。这样收集的沉淀,往往难溶解于TE,可在60水浴放置15分钟以上,以帮助溶解。

8. DNA溶液3000rpm离心5分钟,上清液倒入干净的5ml离心管。

9. 加入5μlRNaseA(10μg/μl), 37 10分钟, 除去RNA(RNADNA的操作、分析一般无影响,可省略该步骤)。

10. 加入1/10体积的3mol/L NaAc体积的冰乙醇,混匀,-20放置20分钟左右,DNA形成絮状沉淀。

11. 用玻棒捞出DNA沉淀,70%乙醇漂洗,再在干净吸水纸上吸干。

12. DNA重溶解于1ml TE, -20贮存。

13. 2μlDNA样品在0.7% Agarose胶上电泳, 检测DNA的分子大小。同时取15μl稀释20, 测定OD260/OD280, 检测DNA含量及质量。

 

方法三:

植物DNASDS提取法:
试验试剂:
1
、研磨缓冲液:称取59.63gNaCl13.25g柠檬酸三钠,37.2gEDTANa分别溶解后合并为一,用0.2mol/LNaOH调至pH7.0,并定容至1000ml
2
10×SSC溶液:称取87.66gNaCl44.12g柠檬酸三钠,分别溶解,一起定容至1000ml
3
1×SSC溶液:用10×SSC溶液稀释10倍。
4
0.1×SSC溶液:用1×SSC溶液稀释10倍。
5
Rnase溶液:用0.14mol/LNaCl溶液配制成25mg/ml的酶液,用1mol/LHClpH5.0,使用前经80水浴处理5min(以破坏可能存在的Dnase)。
6
、氯仿-异戊醇:按24ml氯仿和1ml异戊醇混合。
7
5mol/L高氯酸钠溶液:称取NaClO4·H2O 70.23g,先加入少量蒸馏水溶解再容至100ml
8
SDS(十二烷基硫酸钠)化学试剂的重结晶:将SDS放入无水酒精中达到饱和为止,然后在7080℃的水浴中溶解,趁热过滤,冷却之后即将滤液放入冰箱,待结晶出现再置室温下凉干待用。
9
1mol/LHCl
10
0.2mol/LNaOH
11
、二苯胺乙醛试剂:1.5g二苯胺溶于100ml冰醋酸中,添加1.5ml浓硫酸,装入棕色瓶,贮存暗处,使用时加0.1ml乙醛液〔浓乙醛:H2O150VV)〕。
12
1.0mol/L高酸溶液(HClO4)。
13
0.05mol/LNaOH
14
DNA标准液:取标准DNA25mg溶于少量0.05mol.L-1NaOH中,再用0.05mol/LNaOH定容至25ml,后用移溶管吸取此液5ml50ml容量瓶中,加5.0ml1mol/LHClO4,混合冷却后用0.5mol/LHClO4定容至刻度,则得100μg/ml的标准溶液。

实验步骤:
1
、称取植物幼嫩组织10g剪碎置研钵中,加10ml预冷研磨缓冲液并加入0.1g左右的SDS,置冰浴上研磨成糊状。
2
、将匀浆无损转入25ml刻度试管中加入等体积的氯仿-异戊醇混合液,加上塞子,剧烈振荡30s,转入离心管,静置片刻以脱除组织蛋白质。以4000rpm离心5min
3
、离心形成三层,小心地吸取上层清液至刻度试管中,弃去中间层的细胞碎片、变性蛋白质及下层的氯仿。
4
、将试管置72水浴中保温3min(不超过4min),以灭活组织的DNA酶,然后迅速取出试管置冰水浴中冷却到室温,加5mol/L高氯酸钠溶液〔提取液:高氯酸钠溶液=41VV)〕,使溶液中高氯酸钠的最终浓度为1mol/L
5
、再次加入等体积氯仿-异戊醇混合液至大试管中,振荡1min,静置后在室温下离心(4000rpm5min,取上清液置小烧杯中。
6
、用滴管吸95%的预冷乙醇,慢慢地加入烧杯中上清液的表面上,直至乙醇的体积为上清液的两倍,用玻璃棒轻轻搅动。此时核酸迅速以纤维状沉淀缠绕在玻璃棒上。
7
、然后加入0.5ml左右的10×SSC,使最终浓度为1×SSC
8
、重复第6步骤和第7步骤即得到DNA的粗制品。
9
、加入已处理的Rnase溶液,使其最后的作用浓度为5070μg/ml,并在37水浴中保温30min,以除去RNA
10
、加入等体积的氯仿-异戊醇混合液,在三角瓶中振荡1min,再除去残留蛋白质及所加Rnase蛋白,室温下以4000rpm离心5min,收集上层水溶液。
11
、再按67步骤处理即可得到纯化的DNA液。

方法四:

改进的SDS法提取植物叶片基因组DNA

1、取指甲大小的植物叶片,置于研钵中,加入适量液氮,用研棒磨成粉未(越细越好)。

2、将粉末移入1.5 ml离心管,加入DNA提取洗涤液1.5 ml,轻轻颠倒混匀。

38000 rpm离心10 min,弃上清,加入洗涤液1 ml,混匀,8000 rpm离心10min,弃上清,共洗涤2遍。

4、加入预热的DNA裂解液500 μL,用牙签轻轻搅拌均匀,置65水浴30 min

5、水浴后立即加入苯酚/氯仿/异戊醇500 μL,颠倒数次,这时溶液变为乳白色,10000 rpm离心5min,取上清液至新的1.5ml离心管中。

6、加入55 μL醋酸钾,颠倒混匀,10000 rpm离心10min,取上层清液转移至新的1.5ml离心管中。

7、加入异丙醇300 μL,室温30 min-20放置2 hr12000 rpm离心10min,弃上清,取沉淀,加入500μL70%乙醇,室温放置2 min12000 rpm离心5 min,弃上清,取沉淀。

8、加入30 μL5 g/ml RNase TE缓冲液,37水浴放置1hr

9、离心30 s后,取10 μL0.8%琼脂糖凝胶上进行电泳鉴定。

 

方法五:
植物DNACTAB提取法:
1、称取新鲜叶片2-3g,剪碎放入研钵中,在液氮中研磨成粉末。
2
、将粉末转移到加有7ml经预热的15×CTAB提取缓冲液15ml离心管中,迅速混匀后置于65水浴中,温育30min
3
、取出离心管,冷却至室温,加入氯仿/异戊醇(24:1),充分混匀,室温下2300转离心20min
4
、将上清转移至另一新的15ml离心管中,加入1/10体积10%CTAB和等体积的氯仿/异戊醇。充分混匀,2300rpm离心20min
5
、转移上清至另一新的15ml离心管中,加入等体积1%CTAB沉淀缓冲液,轻轻摇晃至形成DNA絮状沉淀。1000rpm离心10min,使DNA沉淀于管底。
6
、加入1.5-2ml1mol/LNaCl5μlRNase置于56水浴中过夜。
7
、待DNA完全溶解后,加2-3ml4预冷的95%的冰乙醇使DNA沉淀,挑出DNA,置于15ml离心管中,用70%乙醇清洗30min
8
、离心机甩5s,倒出70%乙醇,再用95%乙醇浸泡5min,倒出95%乙醇,在超净工作台上吹干。
9
、将风干的DNA直接在4保存备用或溶于100μlTE溶液中于-20保存。