如何从-80℃冻存的抗凝全血中提取RNA（技术文章）

我们先来看网络上的一个求助帖：

已经积攒了一批抗凝血，由于当时未多加考虑,取标本后就直接放在-80度了，请问:
这样对提取RNA影响大吗？我该怎样防止血液融化时RNA被酶解呢？具体该怎样操作呢？
谢谢。我是新手，请多帮助!!!!
回复
冻存的时间过长，即使温度很低，RNA也可能降解。
你的这种情况，在融解之前在冻块上面加入RNA酶抑制剂溶液后再融解，融解过程中注意抑制剂溶液及时与融化血液混合，不要剧烈振荡。只要RNA在冻存过程没有降解，这样就不会有太大问题。
回复
这样不可避免RNA的降解。
我们也遇到这样的问题，我们的首席教授告诉我们应该在冻存时直接加入TRIZOL。这样可以避免RNA被降解。
回复
非常感谢！只有提提试一下了。
RNA酶抑制剂溶液是指的什么？1 ml血液加多少有要求吗？

从上面的求助帖中我们可以总结出几大信息：

1. 血液直接冻存到-80℃再提取是个大问题，没有人能确切回复可行的操作方案。实际上即使我们查找著名的核酸纯化试剂盒公司QIAGEN的网站，也找不到从-80℃冻存的血液中提取RNA的方法。

2. 血液不加任何试剂直接冻存在-80℃时，RNA会降解吗？如果会降解，多久会降解完？

回复的建议都是猜测性的，没有做过实际的测试。

众所周知，RNA容易降解，所以一般提取RNA都会使用新鲜的样本，如果新鲜样本不能立即提取RNA，应立即放到-80℃冻存—从这一点上讲，发帖的求助者也没做错。但关键是血液中的红细胞不含有RNA，提供RNA的主要是白细胞，市面上主要的血液RNA提取试剂盒（比如QIAGEN）用到的原理是将白细胞与其它组分分离（用红细胞裂解液去除红细胞）再提取其中的RNA。一旦血液经过冷冻就会出现溶血现象，这时所有的细胞都发生破裂，已经无法分离白细胞了，使用这种方法自然也就提不到RNA。

Simgen独创的全血总RNA试剂盒，是无需红细胞裂解液分离白细胞，直接从全血中提取RNA的，是不是能从冷冻的抗凝血中提取到RNA呢？让我们实测一下吧：

实验材料：-80℃冷冻75天的抗凝全血；预先按500 μl血样比1 ml Buffer L9的比例加入Buffer L9的同一个抗凝全血样本作为对照组（备注：Simgen 全血总RNA试剂盒中的Buffer L9与抗凝全血预混后可在-20℃长期冻存，RNA不会降解）。

实验试剂：全血总RNA试剂盒（simgen，Cat.No.5201050）、

cDNA第一链合成试剂盒（simgen，Cat.No.7306025）、

2×SYBR Green PCR Mix（simgen，Cat.No.7106100）、

人β-actin引物（Forward TGACGTGGACATCCGCAAAG

/Reverse：  CTGGAAGGTGGACAGCGAGG）

实验方法：

1. 分两组进行对比实验，每组各做两管：第一组取2个2 ml离心管，各加入500 μl新鲜全血，编号1、2；第二组加入500 μl新鲜全血后再加入1 ml Buffer L9，混合均匀，编号3、4。将两组样本置于-80℃冻存，冻存75天。

2. 75天后取出后置于室温，待血样全部融化后，向1、2中加入1 ml Buffer L9混合均匀；

3. 13000 rpm离心10分钟；

4. 吸取700 μl离心上清转移到装有500 μl无水乙醇的1.5 ml 离心管中，混匀；

5. 分两次将混合液转移到核酸纯化柱中，离心去滤液；

6. 依次用500 μl Buffer WA和700 μl Buffer WBR各洗涤一次；

7. 用50 μl RNase-Free Water洗脱RNA；

8. 在微量紫外分光光度计上测量RNA的浓度；

9. 琼脂糖凝胶电泳；

10. 逆转录制备cDNA；

11. 取5 μl cDNA模板进行RT-PCR检测。

实验结果：

1.在微量紫外分光光度计上用RNase-Free Water调零，测量洗脱下来的RNA，结果如下，

从表一的数据上可以看出两种方法处理的抗凝血经过75天的长期保存后均提取出了RNA，且浓度并无太大差异。

2.在1%的琼脂糖凝胶上，加入8 μl血液RNA，电泳15 min，结果如下，

从图一所示的电泳图中可以看出，四个样本的电泳条带都很清晰。

 3.荧光定量PCRβ-actin基因检测结果，

从图二可以看出，两组不同处理的冷冻全血中提取的RNA经逆转录后获取的cDNA在RT-PCR检测中几乎与阳性同时起线，且Ct值较靠前。

从本次实验可以得出结论：由于Simgen全血总RNA试剂盒可以从血液中直接分离纯化总RNA，不需事先分离白细胞，自然也不怕冷冻血液溶血。本次实验测试，一次可以从500 μl -80℃贮存75天的冷冻全血中提取到3 μg左右的血液总RNA，且纯度很高，完全满足后续基因检测的需要。

最后我们可以对网络上的求助帖做几条有价值的回复了：

1. 在-80℃冻存的抗凝全血，如果用Simgen全血总RNA纯化试剂盒提取RNA则结果影响不大。

2. 抗凝全血在-80℃冻存时间小于75天的，提取到的RNA尚未观察到有严重的降解。

3. 解冻后的抗凝全血立即用Simgen全血总RNA纯化试剂盒提取RNA，即使不加RNA酶抑制剂，RNA也不会被降解。

对具体操作感兴趣的同学，也可以点击观看视频：https://v.qq.com/x/page/g0323yn2iz8.html。

操作视频

Simgen实验室

2017.12.02