土壤DNA 纯化难点——腐殖质

土壤，是由一层层厚度各异的矿物质成分所组成大自然主体。土壤和母质层的区别表现在于形态、物理特性、化学特性以及矿物学特性等方面。由于地壳、水蒸气、大气和生物圈的相互作用，土层有别于母质层。它是矿物和有机物的混合组成部分，存在着固体，气体和液体状态。疏松土壤微粒组合起来，形成充满间隙的土壤的形式。这些孔隙中含有溶解溶液（液体）和空气（气体），因此，土壤通常被视为有多种状态 。

提取土壤中微生物、动植物遗体等的DNA是在分子水平上研究生态、环境保护与修复及菌种筛选等的基础。土壤的成分包括矿物质、粘土等无机物、植物及植物的遗体、腐殖物质等土壤有机物以及在土壤中存在的微生物，其中绝大部分的微生物都是无法直接培养进行繁殖和研究，从土壤样品中提取DNA是研究土壤微生物最为有效的方法。

在整个提取的过程中，腐殖质是最大的干扰因素。腐殖质是已死的生物体在土壤中经微生物分解而形成的有机物质，含有植物生长发育所需要的一些元素，能改善土壤，增加肥力。主要方法是帮助增加可以让空气和水进入的空隙，也同样产生植物必须的氮，硫，钾和磷。动植物残体在微生物作用下形成简单化合物的同时又重新合成复杂的高分子化合物。但是由于腐殖物质的性质与DNA十分相似，从土壤中提取的DNA的同时也会将将腐殖质等物质一起纯化，因而采用一般的DNA提取方法很难除去腐殖物质等抑制因子，再加上这些腐殖物质会抑制聚合酶链式反应（PCR）及限制性酶切等，因此，彻底去除腐殖物质等抑制因子是整个操作过程中的重点，也是难点。

DNA的方法主要有直接法和间接法。直接法是指将土壤样品放在裂解液中，经过有效的破壁方法使微生物的DNA全部释放到裂解液中，然后再进行分离提取的方法。间接法是指将土壤放在一种的缓冲液中，如Buffer PBS等，把微生物从土壤中分离出来，然后再进行DNA的提取。间接法可大大降低土壤中腐殖酸，重金属盐对DNA提取带来的影响，但是这种方法会丢失许多微生物，得到的DNA并非土壤样品中的全基因组(宏基因组)，间接法使用的已经很少了。

目前市面上对于去除腐殖质工艺做的最好的试剂盒，就是MPbio公司的土壤DNA提取试剂盒，该试剂盒能够有效去除土壤样本中的腐殖质，极大提高目标DNA的提取浓度，很多土壤相关工作人员都选用该试剂盒。不过优秀的产品也会有短板，MP试剂盒在有效去除腐殖质的过程中难免会造成目标DNA的损失，操作过程略显繁琐，同时作为一个进口的产品，价格因素可以说是该产品最大的短板。   

杭州新景生物试剂开发有限公司作为新手福音，业界良心，经过一系列的研究，终于开发了一种高效的去腐殖酸缓冲液，最大限度的去除土壤样本中的腐殖质，保留目标DNA，结合硅胶柱纯化的技术，得到高纯度的土壤微生物DNA。

我们的操作方法和一般的提取土壤DNA试剂盒有所不同，先要进行样本的前处理，将土壤样本经过去腐缓冲液洗涤，然后进行DNA提取得到高纯度且不含腐殖酸的土壤DNA。我们可以将多达500 mg的土壤样本放入含有陶瓷颗粒的2.0 ml试管中，首先使用去腐缓冲液洗涤，离心去上清后使用高效裂解液裂解所有土壤生物，包括之前难以裂解的种类，如真细菌孢子和芽孢、革兰氏阳性菌、酵母、藻类、线虫和真菌。离心后取上清与结合液结合，过硅胶柱进行DNA纯化即可得到高纯度DNA。