1、取出细胞、收集上清保存备用
2、用冷PBS冲洗细胞两次
3、加入 1ml Trizol (24孔板每孔加0.5ml即可),调小刻度用移液器吹打细胞至液体澄清(生化:摇动混匀后室温孵育10min)
4、将裂解液转移至1.5ml灭酶EP管中,用黄枪头加入氯仿0.2ml(1/5 Trizol体积),用手剧烈震摇15秒,置室温5min(生化:3min dxyer:15min),分层
5、 4℃、12000g(12300rcf)离心15min,可见分层。
6、用黄枪头小心收集上层水相约0.5ml置于另一1.5ml灭酶EP管中(确保不要吸入中间层和有机相)。
7、各管分别加入0.5ml 异丙醇(等体积),用力摇匀,置室温10min。(提前将异丙醇4℃预冷,或混匀后置-20℃60min,提取效果更好)
8、 4℃、 12000g离心10min,可见RNA沉淀。
9、倒弃上清,用滤纸吸干管口余液,加入预冷的75%灭酶异醇1ml,用指轻弹管壁使RNA沉淀飘起洗涤。
10、4℃、7500g(7700rcf)离心5min,生化为10min,(亦有dxyer用 12000g),沉淀即为总RNA。
11、弃上清,真空干燥约4min或空气中干燥5~10min,加入20μl(30μl)DEPC 水。
12、56℃水浴小于10min助溶,取少量测OD值,其余-70℃保存备