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一直以来，搞植物研究的同学们对Trizol试剂提取植物RNA诟病不断，在这样的背景和需求下，我们特别研发了植物总RNA提取液套装，套装中除了植物总RNA提取液外，还包括了Buffer EX(氯仿替代品)，RNA沉淀液（异丙醇替代品）以及β-巯基乙醇。真可谓一个套装在手，提取植物RNA无烦恼！现在我们特别选择了土豆块茎（Trizol试剂提取失败）和桑叶（Trizol试剂提取效率极低）两个典型样本实测植物总RNA提取液套装的效果。
实验目的：
用植物总RNA提取液套装从桑叶和土豆块茎中提取RNA。
实验材料：
桑树叶片、土豆块茎，研钵，植物总RNA提取液套装（Simgen Cat. No.5123100）
超微量电子天平（DENVER INSTRUMENT，TP-213）
旋涡震荡器（越新仪器，XH-C）
台式离心机（eppendorf Centrifuge 5415 D）
超微量分光光度计（Simgen Cat.No.sim100）
电泳仪（北京六一仪器厂，DYY-6C型 ）
土豆内参引物（F：ATTGGAAACGGATATGCTCCA/R：TCCTTACCTGAACGCCTGTCA）
2×One Step SYBR Green RT-qPCR Mix（Simgen Cat. No.7405500）
荧光定量PCR仪（ABI7500）
实验内容：
1. 在研钵中加入约300 mg小块的土豆块茎或桑树叶片，加入1.8 ml已加入β-巯基乙醇的植物总RNA提取液，然后用研磨棒进行研磨，直至组织呈匀浆状。
2. 吸取700 μl混合液分装到两个1.5 ml离心管中（备注：在植物总RNA提取液套装说明书中步骤1、2要求将植物样本经液氮磨成粉末状后再按每管100 mg的量分装到1.5 ml离心管中，每管再加入600 μl含β-巯基乙醇的植物总RNA提取液）。
3. 加入600 μl Buffer EX，用力混合均匀，13000 rpm离心10分钟。
4. 小心吸取350 μl上清，转入一个洁净的1.5 ml离心管中。
5. 在上清液中加入等体积的RNA沉淀液，盖上管盖混合均匀，13000 rpm离心5分钟。
6. 弃上清，低速离心数秒使管壁上的上清液聚集到管底，用200 μl吸头吸尽残留的上清液。
7. 加入1 ml 70%乙醇，盖上管盖，旋涡震荡悬浮RNA沉淀，13000 rpm离心3分钟。
8. 弃上清，盖上管盖，低速离心数秒使管壁上的乙醇沉降到管底，用200 μl吸头吸尽残留的乙醇，保留管底及管壁的白色RNA沉淀。室温静置5分钟干燥RNA。
9. 根据RNA沉淀量加入适量RNase-free水（土豆块茎样本50 μl，桑叶样本200 μl）旋涡震荡溶解RNA，在超微量分光光度计上测量RNA的浓度，然后进行琼脂糖凝胶电泳。
10. 按照2×One Step SYBR Green RT-qPCR Mix的说明书操作，对提取到的土豆RNA进行荧光PCR扩增。
实验结果：
1. 在微量分光光度计上用RNase-Free Water调零，测量提取好的RNA，结果如下：
1、2是土豆使用植物总RNA提取液套装所获得的总RNA；3、4是桑叶使用植物总RNA提取液套装所获得的总RNA。
2. 在1%的琼脂糖凝胶上，加入5 μl提取到的RNA，电泳20 min，结果如下：
1、2条带是土豆RNA电泳结果；3、4条带是桑叶RNA电泳结果，M是DL2000 Marker。
3、土豆RNA荧光PCR曲线图
实验讨论与分析：
1. 从微量分光光度计测的结果上分析，使用Simgen植物总RNA提取液套装，不论是土豆块茎还是桑叶都获取到了纯度非常高的RNA。通常Trizol试剂提取的RNA会出现的A260/A230值偏低的情况也没有出现。
2. 从电泳图上分析，RNA条带完整，有不明显的基因组DNA污染（土豆RNA）或者根本就观察不到基因组DNA污染（桑叶RNA），与分光光度计测得的数据有较好的对应关系。
3. 从荧光PCR结果上分析，扩增曲线正常，无抑制现象。
综上所述，植物总RNA提取液套装是与Trizol试剂完全不同的产品，不仅不涉及酚氯仿的使用，而且非常适合从高多糖多酚的植物样本中提取RNA。除此之外，植物总RNA提取液套装不仅操作步骤比Trizol试剂更为简单方便，同时又与Trizol试剂一样，对样本的用量没有限制，非常适合一次需要提取非常大量RNA的用户使用。
Simgen实验室
2020.08.28
