石蜡组织DNA提取法

作者:新景实验室
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方法一:

改良TES水浴法

将蜡块组织切片为10μm大小,修剪掉多余的石蜡,取10片置于1.5ml Eppendorf 管中,加入1ml TES溶液充分振荡10min70水浴30min15000r/min 离心15min,弃上清,重复2次。最后1次弃去上清后向管中加入500μl 消化缓冲液,再加入20μl 蛋白酶K (质量浓度5mg/ml),置于55水浴过夜。在沸水中水浴10min,以灭活蛋白酶K。加入等体积饱和酚氯仿-异戊醇(25:24:1),重复抽提3次。最后取上层水相,加入无水乙醇沉淀。70%乙醇充分洗涤DNA,空气干燥,加入50μl TES 溶液溶解,置于-20保存备用。

 

方法二:

二甲苯脱蜡法

将蜡块组织切片10μm ,加入1ml 二甲苯溶液。在37水浴中轻摇10min 4000 r/min 离心15min ,小心吸去二甲苯,重复两次。弃去二甲苯后加入1ml 无水乙醇洗涤,再依次用95%75%25%乙醇进行梯度水化。弃去上清后向管中加入500μl 消化缓冲液,再加入 20μl 蛋白酶K(质量浓度为5mg/ml),置于55水浴中过夜。加入等体积饱和酚氯仿-异戊醇重复抽提3次。最后取上层水相经过沉淀、洗涤、干燥后,于-20保存备用。

 

方法三:

无需脱蜡法(Goelz 法改良)

1、取出已分装好的石蜡组织片,切除多余的石蜡,暴露组织

2、将组织切碎(最大径<0.5mm),称重,放置于2ml 离心管中

3、加入TE9提取液1ml ,高速混悬2~3min,与48水浴郭中放置24h。(TE9 DNA提取液的制备:500mmol/L Tris 20mmol/L EDTA10mmol/LNaCl1%SDS500μg/mlpH8.0

4、再次混悬组织,加入蛋白酶K至终浓度1mg/mlSD2%,孵育24-36h(组织消化完全为宜,微量管液体分层,上层为蜡溶液浑浊层,下层为组织消化澄清液)

5、用等体积酚-氯仿溶液抽提3次,全速离心后可见明显分层,抽提过程中小心抽吸,避开上层蜡层及下层酚相层,吸取中间清亮层;

6、转移上清,加入1/10体积3 M冰冻的NaAC溶液和等体积异丙醇室温放置过夜,次日离心(12000 r/min10 min),收集DNA沉淀;

7、沉淀物用70%乙醇洗1次,去除多余盐分。

8、沉淀干燥后溶于20μTE缓冲液(pH7.2),加入1 μl RNA酶,放置于-4冰箱备存。

 

方法四:

脱蜡法

(1)脱蜡:

①将石蜡包埋的组织标本切片5-8(5μm/每片),放入1.5ml离心管中;

②加入1 ml二甲苯,颠倒混匀,使二甲苯与组织充分接触,放置于48水浴锅中45分钟;

③离心(12 000 r/rain10min),弃上清;

④重复前两步(即用二甲苯脱蜡两次)

⑤加入1 ml无水乙醇,翻转混匀,离心(12000r/min10 min),弃上清,以去除残留二甲苯,此过程也重复两次。

⑥弃上清后,将已脱蜡组织放置于超净台自然干燥。

(2)蛋白酶消化:于脱蜡后组织中加入细胞裂解液200μl,蛋白酶K(20 mg/ml)15 m,混匀,于37水浴锅中温浴至混合物清亮(37-48 h)。在消化过程中,消化24小时时补加一次蛋白酶K(10-15μl)。消化完全后离心(12000 r/min10min),将上清转移至另一微量离心管中。

(3)DNA提取:

①加入等体积的苯酚/氯仿(11)抽提2次,离心(12 000r/min10 min)

②转移上清,加入等体积苯酚/氯仿/异戊醇(25241)抽提1次,离心(12 000 r/min10 min),转移上清;

③加入上清液1/10体积的3 M冰冻NaAC溶液和2倍体积冷乙醇沉淀DNA,于-4冰箱沉淀过夜;

④次日于4离心(12 000 r/rain10 rain),收集DNA沉淀。将沉淀溶于20μl TE缓冲液,加1μl RNA酶,放置于-4冰箱保存待用。

 

方法五:

GpelzDNA提取方法

1.   切除多余石蜡,暴露组织

2.   将组织切碎(最大径<0.5mm),称重;

3.   溶于TE9提取液(组织<50mg/5ml,50500mg/10ml,高速混悬23min;于48℃放置24h

4.   再次混悬组织,加入蛋白酶K至终浓度1mg/ml,SDS2%,孵育40h

5.   用等体积酚-氯仿溶液抽提3

6.   2.5倍体积乙醇沉淀DNA

7.   -70℃放置24h

8.   9000×g离心1h

9.   沉淀物用70%乙醇洗1

10.干燥,TEpH7.2)溶解。


方法六:

1、取蜡块切片 15-20 张(8μm),置于eppendorf 管中,加入 1ml 的二甲苯,37作用 3h,以 10000rpm,离心 3min,倾去二甲苯。重复 3-4 次,观察管壁是否光滑。如果仍有蜡质残存,需继续脱蜡。

2、剃度酒精水化:加入 100%乙醇 1ml,室温下放置 30min,以 10000rpm离心 3min,去上清;再依次分别加入 95%75%50%的乙醇重复上面的步骤。

3、消化:以 1 SSC500μL 加入 SSC 洗涤沉淀,以 12000rpm 离心 3min。弃去上清夜,干燥沉淀。加入石蜡消化液 400μLPK20mg/ml20μl55消化 120h,第四天,补加 PK10μl

4、消化后的液体很清亮,肉眼可见的组织较少。将其转入 98的水浴箱中,煮沸 10min,以灭活 PK,取出后置于冰上,使其迅速冷却。以 10000rpm,离心 5min

5、取上清加等量的酚-氯仿,轻颠倒混匀呈乳白色。低温下以 14000rpm,离心 10min。小心取上清,再加入等量的酚-氯仿重复上面的步骤。

6、取上清加入预冷的两倍体积的无水乙醇及 1/10 的乙酸钠(PH5.2),颠倒混匀。置于-2030min。低温下以 14000rpm,离心 10min,去上清。

7、沉淀用 1ml 70%乙醇洗涤 2 次,颠倒 eppendorf 管数次)14000rpm,(以离心 5min,,自然干燥沉淀。

8、加 TE20μl,(含 RNA 酶),4下过夜。