随着2019年底在武汉出现的由新型冠状病毒引起肺炎的疫情发展至全国，新型冠状病毒核酸检测诊断试剂盒需求量也激增。病毒核酸检测由两块内容组成：核酸提取+PCR检测，对于病毒RNA检测来说，病毒RNA提取反而是核酸检测的重头戏。因为病毒RNA的数量很低（pg级别）且容易降解，提取过程费时费力，以至于提取的病毒RNA的效率直接就决定了检测的灵敏度。本文以实验数据对比方式说明如何提高病毒核酸检测灵敏度。
下面是中国疾控中心公布的检测新冠病毒的引物、探针序列：
推荐选用针对新型冠状病毒的开放读码框1ab（open reading frame,ORF1ab）、核壳蛋白（nucleoprotein，N）基因区域的引物和探针。
Target 1（ORF1ab）:
正向引物（F）：CCCTGTGGGTTTTACACTTAA
反向引物（R）：ACGATTGTGCATCAGCTGA
荧光探针（P）：5'-FAM-CCGTCTGCGGTATGTGGAAAGGTTATGG-BHQ1-3'
Target 2（N）:
正向引物（F）：GGGGAACTTCTCCTGCTAGAAT
反向引物（R）：CAGACATTTTGCTCTCAAGCTG
荧光探针（P）：5'-FAM-TTGCTGCTGCTTGACAGATT-TAMRA-3'
也就是说如果大家手头有类似Simgen的2×One Step Probe RT-PCR Mix（Cat. No. 406100），合成引物探针后，就可以自制新型冠状病毒核酸检测试剂盒了。如前文所说，核酸检测由两块内容组成：核酸提取+PCR检测，病毒RNA提取是核酸检测的重头戏。因为病毒RNA的数量很低（pg级别）且容易降解，提取病毒RNA的效率直接就决定了检测的灵敏度。所以一些不负责任的核酸诊断试剂盒厂家采用了逃避手法：只提供荧光PCR检测试剂，让用户自己去找核酸提取方法……好吧，假如你运气不好，需要自己选择病毒核酸提取方法或你诊断试剂盒厂家但遇到病毒核酸检测灵敏度低问题，此文章应该挺有价值。
新景实验室接下来用三种方法做病毒RNA提取，来说明提高新型冠状病毒检测灵敏度的有效方法。这三种病毒RNA提取方法分别是：
1）一般实验室最常见的Trizol试剂来进行病毒RNA的提取;
2）Trizol试剂 添加Carrier RNA来进行病毒RNA的提取;
3）病毒核酸纯化试剂盒来进行病毒RNA的提取（含Carrier RNA）;
（需要说明的一点是：我们新景实验室不是P3实验室，不敢玩新冠病毒，我们以同样是RNA病毒的丙肝病毒血清样本进行实验测试的，请大家谅解。）
一、样本、试剂与仪器
1、 丙肝病毒阳性血清，****医院检验科提供，经达安基因公司丙型肝炎病毒(HCV)核酸检测试剂盒（PCR-荧光探针法） 产品检测病毒浓度为105 copies/ml。
用混合的人阴性血清将105 copies/ml丙肝病毒阳性血清病毒稀释10倍获得104 copies/ml血清；再用混合的人阴性血清将104copies/ml丙肝病毒阳性血清病毒稀释10倍获得103 copies/ml血清。
2、 Simgen病毒核酸纯化试剂盒（Cat. No. 4002050）;
Simgen Trizol试剂（Cat. No. 5301100）;
Simgen Carrier RNA（Cat. No. 4003101）
3、 HCV检测试剂盒：Acon丙型肝炎病毒核酸定量测定试剂盒(PCR-荧光法)
4、 PCR仪：ABI PRISM® 7000 Sequence Detection System
5、 离心机：Thermo Biofuge pico
二、测试方法
1、用Simgen病毒核酸纯化试剂盒、Trizol加Carrier RNA、Trizol试剂分离纯化同一管103 copies/ml血清样本中的病毒RNA。（Trizol提取方法：1ml Trizol试剂/1ml Trizol试剂含3 μl Carrier RNA + 200 μl血清混匀→+氯仿混匀→离心取750 μl上清+600 μl异丙醇→离心后用75%乙醇洗涤→50 μl RNase-free水溶解，具体细节请自行脑补）
2、三种方法均每次均从200 μl血清中分离纯化病毒RNA，各重复一管，RNA最终洗脱/溶解体积为50 μl。
3、 三种病毒RNA提取方法获得的病毒RNA均取10 μl作为模板扩增，终反应体积为40 μl，使用同一批次的Acon丙型肝炎病毒核酸定量测定试剂盒(PCR-荧光法)进行扩增。（注：Acon丙型肝炎病毒核酸定量测定试剂盒(PCR-荧光法)RT-PCR实际循环数为45个循环，反应条件如下：42℃ 30min, 95℃ 3min, [95℃ 10sec, 55℃ 30sec, 72℃ 1min(5次循环)]，[95℃ 5sec, 60℃ 32sec (40次循环)]）
三、实验结果
1、 反应体系的阴性对照中加10 μl 水作为模板，检测结果为阴性。
2、 用不同方法提取的103copies/ml血清样本，检测结果如下图：
四、分析与讨论
1. 从检测结果看，Trizol试剂终究还是扩增起线了，只是CT值很大，趴下去了。Trizol试剂加了Carrier RNA后起线正常。但是比病毒核酸纯化试剂盒大了差不多两个CT值。
2. Trizol试剂在提取103 copies/ml血清样本的时候，起线艰难，我们很担心提取102 copies/ml血清样本的时候还能不能起线，所以我建议那些宣传自己产品检测灵敏度高达102 copies/ml的厂家，是不是要限制一下配套的病毒核酸提取方法，否则有虚假宣传的嫌疑。
3. Trizol试剂加了Carrier RNA后，起线简直有了质的飞越，怎么解释？其实也简单：pg级的病毒RNA沉淀效率太低了，但是在纯化体系中加了μg级的Carrier RNA后，沉淀病毒RNA效率完全就不是一个级别的了，我们一起看下照片：
大家都知道，RNA比DNA要脆弱得多，很容易降解，当然100℃不失活的强悍RNA酶是罪魁祸首，Carrier RNA的存在，对于掩护病毒RNA不被RNA酶攻击，也是有重大意义的。Trizol试剂提取的病毒RNA扩增曲线趴倒，不排除病毒RNA被降解，导致扩增困难的可能性。
4．虽然Trizol试剂加了Carrier RNA后起线好了很多，但是和病毒核酸纯化试剂盒（含 Carrier RNA）比较，还是大了两个CT值，也就是说病毒核酸纯化试剂盒提取病毒RNA的效率是Trizol试剂+Carrier RNA的4倍，怎么解释呢？这要从Trizol试剂提取RNA的原理说起：Trizol是硫氰酸胍+苯酚+乙酸的混合物，硫氰酸胍负责变性溶解蛋白（对于病毒颗粒最有价值的是溶解蛋白外壳）；苯酚负责萃取变性的蛋白质；乙酸负责维持低pH值，确保DNA维持不溶解的状态。首先在溶解病毒颗粒的环节，以胍盐溶解蛋白（病毒颗粒）的效率低于蛋白酶K消化蛋白（病毒颗粒），使得病毒RNA的释放效率低了一级，其次又在苯酚萃取的环节，由于刻意的调低pH（目的是去掉DNA，个人认为调高pH有助于病毒RNA的回收效率，毕竟宿主的DNA并不干扰病毒RNA的扩增），导致一部分病毒RNA又随着相间沉淀丢失了。两个不利因素的累积，是Trizol试剂提取病毒RNA效率低的主要原因。
其实Trizol试剂用作病毒RNA的提取，并非是最好的选择，但优点是几乎所有的分子生物学实验室都能拿到。Trizol试剂用作新冠病毒RNA提取检测时，灵敏度要达到102 copies/ml应该是有困难的，如果用Trizol试剂检测某些样本的结果和本次实验相似（趴到的线），建议在Trizol试剂中补加Carrier RNA 以提高RNA提取效率，或者购买病毒核酸纯化试剂盒重测，以免漏检或者误判阳性样本。（当然选病毒核酸纯化试剂盒的时候也同样关注是否有Carrier RNA，Carrier RNA 是高灵敏度试剂盒必备)。
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【以上文中实验所用Simgen Carrier RNA（Cat. No. 4003101）供货于华大智造，是华大基因（华大智造）新冠病毒核酸检测试剂盒配套试剂，同时也是生工sangon等厂家的 Carrier RNA 供应商】
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参考文献
[1] nmdc.cn. (2019). 国家病原微生物资源库 新型冠状病毒核酸检测引物和探针序列 信息来源：中国疾病预防控制中心 病毒病预防控制所. [online] Available at: http://nmdc.cn/#/nCoV
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