如何从全血中提取DNA

作者:新景实验室
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从血液中提取DNA的方法有很多,有最传统的酚-氯仿法,也有后来改良的试剂盒方法,选择合适的提取方法,要综合考虑操作时间、提取效率以及性价比。我们收集了常见的全血DNA提取方法,并对它们的性能做出一个简单的评估。

-氯仿法

1. 加入5倍红细胞裂解液去除红细胞,此步骤一般需要15-30分钟;

2. 加入细胞裂解液、蛋白酶K,混匀,置于50℃水浴3小时;

3. 将消化好的液体移入1.5 ml EP管中,加入等体积饱和酚,混匀,14000 rpm离心5分钟;

4. 吸取上清转入另一EP管中,加入等体积的酚氯仿(饱和酚和氯仿醇11),混匀,14000 rpm离心5分钟;

5. 将上清液转入另一EP管中,加入1/10体积的NaAC(醋酸钠)和等体积的异丙醇(或2倍体积的乙醇),混匀,置于-20℃冰箱中3小时;

6. 14000 rpm10分钟,弃去上清

7. 加入1 ml 70%乙醇,温和摇晃几次,14000 rpm10分钟,弃去上清;

8. 70%乙醇重复洗涤1次;

9. 将洗涤好的DNA置于超净工作台干燥10分钟

10. 加入50-80 μl TE或去离子水溶解沉淀DNA,置于-20℃保存。

-氯仿法抽提DNA的原理是通过有机溶剂抽提,去除蛋白,多糖,酚类等杂质,再加入乙醇沉淀即可使核酸分离出来。其优点是不限制初始样本量,缺点是其试剂对人体有毒害作用,且操作繁琐,耗时很长,所以酚-氯仿法基本被现在的试剂盒方法取代。

 Qiagen QIAamp DNA Blood Mini Kit法(适用于200 μl全血)

1. 1.5 ml离心管底部加入20 μl蛋白酶k,加入200 μl全血样本;

2. 加入200 μlBuffer AL,旋涡震荡15 秒;

3. 56℃水浴10分钟;

4. 短暂离心收集离心管盖上的液体;

5. 添加200 μl无水乙醇,旋涡震荡15秒混匀,短暂离心收集离心管盖上的液体;

6. 过吸附柱,8000 rpm离心1分钟,弃滤液;

7. 加入500 μl Buffer AW18000 rpm离心1分钟,弃滤液;

8. 加入500 μl Buffer AW214000 rpm离心3分钟,弃滤液;

9. 最高速离心1分钟;

10. 加入100-200 μl洗脱液,室温静置1分钟,8000 rpm离心1分钟,将DNA洗脱下来。

Tiangen血液基因组DNA提取试剂盒法(适用于200 μl全血,大于200 μl要加细胞裂解液)

1. 200μl抗凝全血,加入200μl缓冲液GB和蛋白酶K,混匀,56℃水浴10分钟;

2. 室温放置2-5分钟后加入350μl缓冲液BD,充分混匀;

3. 过吸附柱,12000 rpm离心30秒,弃滤液;

4. 加入500 μl缓冲液GDB12000 rpm离心30秒,弃滤液;

5. 加入600 μl缓冲液PWB12000 rpm离心30秒,弃滤液,重复洗涤一次;

6. 12000 rpm2分钟,弃废液,吸附柱室温静置2分钟;

7. 加入50-200 μl洗脱液,室温静置2分钟,12000 rpm2分钟,将DNA洗脱下来。

Simgen全血DNA小量试剂盒法(适用于400 μl全血,小于400 μlBuffer L1:抗凝全血:Buffer L2=3:4:3的体积比进行操作)

1. 300 μl Bufer L11.5 ml离心管,加入400 μl抗凝全血,旋涡震荡30秒;

2. 加入300 μl Bufer L2,旋涡震荡30秒;

3. 13000 rpm离心2分钟;

4. 离心上清倒入核酸纯化柱,12000 rpm离心30秒,弃滤液;

5. 加入500 μl Buffer WA洗涤一次,12000 rpm离心30秒,弃滤液;

6. 加入600 μl Buffer WB洗涤一次,12000 rpm离心30秒,弃滤液;

7. 14000 rpm离心1分钟;

8. 加入100-200 μl洗脱液,室温静置1分钟,12000 rpm离心30秒,将DNA洗脱下来。

以下是某一检测公司对上述三款试剂盒从操作时间、提取效率以及价格这三个性能方面做出的测评。




总结如下:

1. 从操作步骤的简便性上看,Simgen试剂盒更胜一筹,实测从6个血液样本中提取DNA耗时30分钟;Tiangen耗时最长,70分钟。

2. 从提取的DNA纯度上看,三个厂家的产品获得的DNA纯度都在1.8左右,差别不大。

3. 从提取的DNA浓度上看,QiagenTiangen提取的DNA浓度差别不大,Simgen试剂盒提取的DNA浓度最高,接近QiagenTiangen的浓度一倍。当然,必须指出,Simgen一次是从400μl全血提取的DNA量。

4. 从产品报价上看,Qiagen产品提取一次血液中的DNA需要35.4——实在是太贵了;Tiangen的最便宜,7.5元一次。

综合考虑,如果用户对提取的DNA浓度要求较高,且追求简便快捷的操作体验的,可以考虑选择Simgen的产品;如果想省钱,愿意多花点时间的,可以选择Tiangen的试剂盒;Qiagen的试剂盒属于实验室的奢侈品,除了品牌比较响亮,速度比Tiangen快一点外,价格和操作的简便性都比不过Simgen的产品。

 Simgen实验室