是谁偷吃了实验室的培养基?续

作者:新景实验室
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还记得前段时间偷吃实验室培养基的真菌吗?之前小新用植物/真菌DNA试剂盒(Simgen Cat.No.3200050提取了该真菌的基因组DNA这次小新用提取的DNA进行PCR扩增然后PCR产物送去基因测序,NCBI与已知菌种序列进行比对后得出该菌种为曲霉属Aspergillus sp.。下面就跟小新一起回顾一下具体的操作步骤

 

实验目的:

鉴定未知真菌菌种。

 

实验材料:

1. 提取好的真菌DNA

2. 2×PCR MixSimgen Cat.No.7003100)、真菌ITS引物(ITS15?-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3’/ITS45?-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3?和(ITS55?-GGAAGTAAAAGTCGTAACAAGG-3?/ITS45?-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3?

3. PCR仪:Techne FPROGO5Y Progene Thermal

4. 电泳仪(北京六一仪器厂,DYY-6C型 )

5. 相关网址:https://www.ncbi.nlm.nih.gov/

 

实验内容

1. PCR扩增:

① 2×PCR MixddH2O、模板DNA和引物室温解冻,置于冰上。

② 将解冻后各个组分上下翻转混合均匀,按下列组成配制PCR反应液

③ 手指轻弹PCR反应管充分混匀,简短离心。

④ 按下方条件设置PCR程序

94℃4 min94℃45 s55℃45 s72℃1 min×35 cycles72℃5 min

2. PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳检测

3. 将获得的PCR扩增产物及引物交由测序公司测序。

4. NCBI网站上对比序列,确定真菌菌种。

打开NCBI选择BLAST选择Nucleotide Blast,在Enter Query Sequence序列框内输入核苷酸序列,输入Job Title,在默认条件下BLAST,得到结果。

5. MEGA5碱基序列比对

打开MEGA5,将菌种的碱基序列输入,点击W进行比对,删除两端不能比对的碱基序列,将比对结果保存。关闭页面,在主页面打开Analysis→Phylogeny→Construct/Test Neighbor-Joining Tree...参数选择Bootstrap method输入1000,开始建树。

 

实验结果

1. 凝胶电泳结果:

1%的琼脂糖凝胶上,加入5 μl扩增产物、DL2000 DNA Ladder,电泳15分钟,结果如下

2. 序列比对结果:

NCBI Nucleotide BLAST结果截图(部分)如下



通过MEGA5软件对未知菌种及其相似菌株核苷酸序列进行比

对,删除两侧多余的不能比对的序列,对未知菌种及其相似菌株核苷酸序列分别建立系统发育树,结果如下:


讨论与分析

1. 本次真菌鉴定是通过扩增并测序未知菌种的ITS序列,然后与已知真菌ITS序列比较,从而获得未知真菌的种属信息。为了提高准确率,使用了两对引物分别进行扩增、测序和对比。

2. 从电泳图能看到,两对引物均扩增出了条带,且位置差不多,序列对比结果也几乎一致。根据NCBI BLAST的结果来看,未知菌种应属曲霉属Aspergillus sp.)。其菌种核苷酸序列与Aspergillus sydowiiAspergillus versicolor等曲霉属的菌种核苷酸序列比对结果相似度都很高

 

综上,最终确定了这个偷吃了实验室培养基的真菌是一种曲霉菌。