如何提取大豆种子RNA

作者:新景实验室
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前段时间有客户询问说是用Trizol提取大豆种子RNA失败了,要如何才能提取大豆种子RNATrizol作为一种经典RNA提取方法,确实应用广泛,但在提取植物样本的RNA时就很容易出现问题。大豆种子中含有较多的蛋白质、脂肪和碳水化合物等丰富的营养物质,最大的可能是大豆种子中的多糖类物质(碳水化合物)和Trizol中的硫氰酸根凝结成了不溶物,导致RNA释放不出来,从而影响了RNA的提取。

还好小新手头上有两种不含硫氰酸根组分的植物RNA试剂盒,一种是植物RNA试剂盒(Simgen Cat.No.5101050,这款试剂盒与国内知名品牌T***GEN的多糖多酚植物总RNA提取试剂盒的操作步骤、提取效果都是一致的;另一高多糖多酚植物总RNA试剂盒(Simgen Cat.No.5103050,这款产品是专门为高多糖多酚样本而生的,能解决植物RNA试剂盒束手无策的样本(有兴趣的同学可以了解下这篇文章——《高多糖多酚植物总RNA试剂盒哪家强?》)。接下来就让小新用两种试剂盒对比提取一下大豆种子的RNA,看看能否成功,效果又是如何。

 

实验目的:

对比Simgen的两种植物RNA试剂盒在提取大豆种子RNA时的性能差异。

 

实验材料:

新鲜大豆种子、一次性手术刀、研钵

高多糖多酚植物总RNA试剂盒(Simgen Cat.No.5103050)、植物总RNA试剂盒(Simgen Cat.No.5101050

超微量电子天平(DENVER INSTRUMENTTP-213

旋涡震荡器(越新仪器,XH-C

台式离心机(eppendorf Centrifuge 5415 D

超微量分光光度计(Simgen Cat.No.sim100

电泳仪(北京六一仪器厂,DYY-6C型)

 

实验方法:

由于大豆非常容易研碎,本次实验采用裂解液浸泡样本研磨法破碎样本后提取RNA,具体操作步骤如下:

Simgen高多糖多酚植物总RNA试剂盒

Simgen植物总RNA试剂盒

1. 称取300 mg组织放入研钵中。加入1.8 ml已加入β-巯基乙醇的Buffer RCT,充分研磨直至组织呈匀浆状,分别吸取700 μl匀浆液(按100 mg组织换算成100 μl匀浆物+600 μl裂解液计算)到2RNase-free1.5 ml离心管中;

2. 600 μl Buffer EX用力混合均匀后12000 rpm离心5 分钟;

3. 吸取350 μl上清于洁净的1.5 ml管中,加入350 μl Buffer K混合均匀,混合液全部转移到过滤柱中,13000 rpm离心1分钟

4. 弃过滤柱,向滤液中加入700 μl 70%乙醇混合均匀,将混合液分两次加入核酸纯化柱中,离心弃滤液;

5. 依次加入500 μl Buffer WA600 μl Buffer WBR洗涤;

6. 14000 rpm空离1 min去除残留乙醇;

7. 将核酸纯化柱置于洁净的RNase-free1.5 ml离心管中,在纯化柱的膜中央加入100 μl RNase-Free Water,室温静置1 min,离心洗脱得到RNA

1. 称取300 mg组织放入研钵中,加入1.8 ml已加入β-巯基乙醇的Buffer RLC,充分研磨直至组织呈匀浆状,分别吸取700 μl匀浆液(按100 mg组织换算成100 μl匀浆物+600 μl裂解液计算)到2RNase-free1.5 ml离心管中,13000 rpm离心2分钟;

2. 将步骤1中的上清液全部倒入过滤柱中,盖上管盖,13000 rpm离心2分钟。

3. 弃过滤柱,此时滤液上层漂浮着一层白色油脂,小心吸取下层液体转移到一个洁净的1.5 ml管中加入600 μl 70%乙醇混合均匀,将混合液分两次加入核酸纯化柱中,离心弃滤液

4. 依次加入500 μl Buffer WA600 μl Buffer WBR洗涤;

5. 14000 rpm空离1 min去除残留乙醇;

6. 将核酸纯化柱置于洁净的RNase-free1.5 ml离心管中,在纯化柱的膜中央加入100 μl RNase-Free Water,室温静置1分钟,离心洗脱得到RNA

 

实验结果:

1、在超微量分光光度计上用试剂盒内的RNase-Free Water调零,测量洗脱下来的RNA,结果如下:

 

2、1%的琼脂糖凝胶上,加入5 μl洗脱的RNA进行电泳,结果如下:


分析与讨论:

1. 浓度测量结果可以看出Simgen的两种植物RNA试剂盒均能提出大豆种子中的RNA,植物总RNA试剂盒提取的RNA平均浓度约为275.3 ng/μl,而高多糖多酚植物总RNA试剂盒提取的RNA平均浓度约为489.3 ng/μl,浓度更高;从电泳结果也能看出高多糖多酚植物总RNA试剂盒提取的RNA条带更亮,与浓度数值有很好的对应关系。因此高多糖多酚植物总RNA试剂盒提取大豆种子RNA的效果更好。

2. 使用植物总RNA试剂盒大豆种子加裂解液研磨离心(步骤1)后,会发现有一层白色油脂漂浮于上清液表面过滤柱过滤(步骤2后仍有残留(见下图)。为避免油脂对后续RNA的洗涤和洗脱造成影响,因此增加了步骤3中“此时滤液上层漂浮着一层白色油脂,小心吸取下层液体转移到一个洁净的1.5 ml管中”的操作,使得操作变得更麻烦了。


 
综上,虽然两种试剂盒均能提取大豆种子的RNA,但是高多糖多酚植物总RNA试剂盒效果更好,不仅提取的浓度更高,而且排除了大豆种子中油脂的干扰,操作显得更为方便。