如何从唾液中提取到更多的DNA

作者:新景实验室
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近些年来,随着基因检测和健康体检的普及,唾液样本由于其无痛采集、采样方便的优点变成了一种非常好的DNA来源样本。一般采集唾液前,为了尽可能提高DNA的得率,会要求采样者半小时内不进食或饮水。那么唾液中到底有多少DNA呢,怎样才能提高唾液DNA的得率呢?抱着这样的疑惑,我们进行了以下实验

实验目的

探究唾液中的DNA浓度范围以及如何提高唾液DNA的回收量。

实验材料

1. 唾液样本

2. 唾液DNA纯化试剂盒(Simgen Cat.No.3501050);

3. 旋涡荡器(越新仪器,XH-C

4. 台式离心机(eppendorf Centrifuge 5415 D

5. 超微量分光光度计(Simgen Cat.No.sim100

6. 电泳仪(北京六一仪器厂,DYY-6C型 )

实验内容

本次实验测试5位实验者在不进食或饮水2小时后的唾液DNA浓度以及1位实验者不进食或饮水不同时间后的唾液DNA浓度(为防止连续采集唾液对DNA浓度会有影响,改为每天采集一次)

1. 用洁净的一次性水杯收集1-2 ml唾液,转移400 μl唾液到一个洁净的1.5 ml离心管中,加入400 μl Buffer L5剧烈摇晃离心管35次,再旋涡振荡30秒混匀,最高速(≥12000 rpm)离心1分钟。

2. 将离心上清液倒入核酸纯化柱中,盖上管盖,12000 rpm离心30弃滤液。

3. 在核酸纯化柱中加入700 μl Buffer WA盖上管盖,12000 rpm离心30弃滤液。

4. 在核酸纯化柱中加入800 μl Buffer WB盖上管盖,12000 rpm离心30弃滤液。

5. 14000 rpm空离1分钟,去除残留液体

6. 将核酸纯化柱置于一个洁净的1.5 ml离心管中,在纯化柱的膜中央加入100 μl Buffer TE,盖上管盖,室温静置2分钟,12000 rpm离心30,得到DNA

实验结果:

1. 在超微量分光光度计上用Buffer TE调零,测量提取好的DNA,结果如下:

表一:不同人提供的唾液样本提取的DNA浓度


ABCDE5位实验者在不进食、饮水2小时后提供的唾液样本提取出的唾液DNA

表二:同一人在不同条件下提供的唾液样本提取的DNA浓度



条件123同一位实验者在不进食、饮水不同时间后(0.5小时1小时1.5小时)提供的唾液样本提取出的唾液DNA

4和5是同一唾液样本,是该实验者在不进食、饮水2小时后提供的唾液样本,4和123一样是直接进行提取,5则是在添加Buffer L5试剂后置于37℃摇床震荡2小时(模拟唾液采集器采集唾液后运输的效果)再提取的唾液DNA123同一位实验者在不进食、饮水不同时间后(0.5小时1小时1.5小时)提供的唾液样本提取出的唾液DNA

2. 1%的琼脂糖凝胶上,加入5 μl提取到的唾液DNA电泳15 min,结果如下:


ABCDE5位实验者在不进食、饮水2小时后提供的唾液样本提取出的唾液DNA的电泳结果

123是同一位实验者在不进食、饮水后的不同时间(0.5小时、1小时、1.5小时)提供的唾液样本所提取出的唾液DNA的电泳结果

45是同一唾液样本,是该实验者在不进食、饮水2小时后提供的唾液样本所提取出的唾液DNA的电泳结果,4123一样是直接进行提取,5则是在添加Buffer L5试剂后置于37℃摇床2小时提取的唾液DNA

讨论与分析

1. 从表一数据分析可知,不同个体提供的唾液样本DNA含量差异非常大,5位实验者中,最低的只提取了0.9 μg DNA,而最高的则提取到了11 μg DNA,有10倍的差异。

2. 从表二1234的数据分析可知,对于同一个体而言,唾液中DNA含量相对比较稳定。通过延长不进食、饮水的时间,唾液DNA含量确实有所提高,因此可以通过选择合适的时间段采集唾液以达到提高唾液DNA浓度的目的

3. 从表二45的数据分析可知,延长唾液和Buffer L5的混合时间,可以有效提高唾液DNA的得率。原因是Buffer L5与唾液中的细胞混合时间越长,基因组DNA就释放得越充分。因此如果使用的是唾液DNA采集器(Simgen Cat.No.3521001,含有Buffer L5)收集后邮寄的唾液样本,DNA的回收量会比直接收集唾液样本提取的DNA更高。

4. 最后我们总结如下:

1) 不同个体提供的唾液样本中DNA含量差异非常大,从400 μl提取到的DNA,数量大概在1~11μg的范围波动。

2) 由于唾液中DNA的含量本质上是唾液中所含的口腔上皮细胞和白细胞数量所决定的。因此我们猜测这种差异终究还是由不同个体的差异所决定:一个原因是有的人的口腔上皮细胞容易脱落,有的人却不容易脱落,就非常类似于不同的人的头皮屑数量的差异。其次就是口腔溃疡或者牙龈炎等因素又会非常大地影响唾液中白细胞的数量。

3) 针对同一个个体,唾液中白细胞的数量相对来说就比较恒定了,影响的因素主要是唾液中脱落的口腔上皮细胞的数量。为了使唾液中的口腔上皮细胞含量达到最大值,可以选择经过一夜睡眠后早晨醒来未喝水状态下采集唾液,当然如果同时使用唾液DNA采集器(Simgen Cat.No.3521001)采集唾液,存放一段时间后提取DNA效果会更好

4) 当我们碰到了唾液中DNA含量低的样本时,还有一个补救的方法,就多提取几管同一个样本中的DNA,然后在操作步骤2时将各个不同管的离心上清多次滤过同一个核酸纯化柱,这样就可以让DNA富集到同一个纯化柱上,达到提高DNA浓度的目的了。