如何检测RNase Inhibitor的性能

作者:新景实验室
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众所周知,RNA非常脆弱,因为环境中到处都有它的天敌——RNA酶,一不小心RNA就被降解了。而RNase Inhibitor的出现很好地解决了这一问题,它能与RNA酶结合,抑制RNA酶的活性,从而保护RNA,因此在很多RT-PCR实验中,添加RNase Inhibitor必须的,那么如何判断RNase Inhibitor的性能效果呢?今天我们就给大家介绍两种RNase Inhibitor性能检测方法。

实验目的:

用不同方法对RNase Inhibitor性能效果进行检测。

实验材料:

1. 检测RNase Inhibitor两种方法检测的不是同一批次和对照RNase Inhibitor40 U/μl

2. RNase A50 mg/mlSimgen Cat.No.8001001

3. RNA样本:大鼠肌肉组织RNACarrier RNA

4. Rat β-acting引物ForwardCCCATCTATGAGGGTTACGC/ReverseTTTAATGTCACGCACGATTTC  

5. cDNA第一链合成试剂盒(Simgen Cat.No.7306025)、2×SYBR Green PCR MixSimgen Cat.No.7106100

6. 荧光PCR仪(ABI 7000

7. PCR仪(Techne FPROGO5Y Progene Thermal

8. 台式离心机(eppendorf Centrifuge 5415 D

9. 电泳仪(北京六一仪器厂,DYY-6C型 )

实验方法与结果

方法一:荧光PCR

1. RNase A梯度稀释至5 ng/μl

2. cDNA第一链合成试剂盒中的试剂、大鼠RNA317 ng/μl)、2×SYBR Green PCR Mix、引物在室温(15-25℃)解冻,解冻后迅速置于冰上。使用前将每种溶液混匀,简短离心。

3. 按照表1的基因组DNA去除体系配制混合液,彻底混匀。简短离心,并置于37℃,孵育30 min,以保证RNase A有充分时间去降解RNA。然后置于42℃,孵育3 min,置于冰上放置。

编号

试剂

阴性对照

对照组

检测组

空白对照

1

2

3

4

5

6

7

8

5×gDNA Buffer(μl)

2

2

2

2

2

2

2

2

RNA(μl)

3

3

3

3

3

3

3

3

RNase A(ng)

1.6

1.6

1.6

1.6

1.6

1.6

--

--

RNase Inhibitor(μl)

--

--

1

1

1

1

--

--

RNA-Free H2O(μl)

补足到10μl

 表1  gDNA去除反应体系

注:为避免RNARNase A接触提前发生降解,预先将RNase InhibitorRNase A按比例混合后再加入体系。

4、按照表2的反转录反应体系配制混合液。

5× RT Buffer

4μl

RT Enzyme Mix

2μl

RT Primer Mix

4μl

反转录反应体系

5、将反转录反应体系中的混合液,加到gDNA去除反应体系的混合液中,充分混匀,简短离心以收集残留在管壁的液体。

6、42℃,孵育15 min

7、95℃,孵育3 min之后放于冰上。

8、2×SYBR Green PCR MixRat β-acting引物配置反应液,取5 μl cDNA进行荧光PCR检测。


根据扩增
结果可知阴性对照组12CT值为25.7825.04,平均值为25.41对照组(34CT值为20.0319.84,平均值为19.935检测组(56CT值为21.7021.34,平均值为21.52空白对照组(78CT值为19.2819.56,平均值为19.42。由此得出结论,阴性对照组CT值比空白对照组CT值大,说明其中的RNA有部分被RNase A降解了;而检测组CT值比阴性对照组CT值小,比对照组CT值大,说明检测组的RNase Inhibitor确实起到了抑制RNase A的作用效果没有对照组好。实验结果:

方法二:电泳法

1. RNase A50 mg/ml)稀释至10 ng/ul1 ng/ul0.1 ng/ul0.01 ng/ul,按下表配置反应体系,两组检测组(检测RNase Inhibitor和对照RNase Inhibitor),一组阴性对照(不加RNase Inhibitor)以及一组空白对照组,平行做两管。

检测组

Rnase A

10 ng/ul

Rnase A

1 ng/ul

Rnase A

0.1 ng/ul

Rnase A

0.01 ng/ul

5xRT Buffer

4μl

4μl

4μl

4μl

RNase Inhibitor

1μl

1μl

1μl

1μl

Rnase A

2μl

2μl

2μl

2μl

RNA500 ng/μl

1μl

1μl

1μl

1μl

RNase-free Water

12μl

12μl

12μl

12μl

阴性对照

Rnase A

10 ng/ul

Rnase A

1 ng/ul

Rnase A

0.1 ng/ul

Rnase A

0.01 ng/ul

5xRT Buffer

4μl

4μl

4μl

4μl

RNase Inhibitor

-

-

-

-

Rnase A

2μl

2μl

2μl

2μl

RNA500 ng/μl

1μl

1μl

1μl

1μl

RNase-free Water

13μl

13μl

13μl

13μl


空白对照组

 

RNA500 ng/μl

1μl

RNase-free Water

19μl

2. 混匀离心,37℃水浴1 h

3. 5 ul混液+1 ul 6×Loading Buffer,进行琼脂糖凝胶电泳。

实验结果:


从电泳结果分析,加了RNA酶的样本,随着RNase A浓度的减少,降解更慢,从降解情况看,对照组RNase Inhibitor和检测组RNase Inhibitor效果差不多。

讨论与分析:

1. 两种方法都可以对RNase Inhibitor的效果性能进行一种有效的检测。荧光法比较直观,可以准确的通过CT值大小得出结论;电泳法相对而言实验结果没有荧光PCR法准确,只能简单通过肉眼判断差异,但是胜在操作更加简单、方便快捷。

2. 如果想要精确判断检测的RNase Inhibitor具体活力浓度,推荐使用荧光PCR法;如果只想粗略判断RNase Inhibitor效果,可以使用电泳法。