震惊!Simgen高多糖多酚植物总RNA试剂盒的严重缺陷!

作者:新景实验室
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之前小新向大家隆重介绍了一款提取植物RNA的强效产品——高多糖多酚植物总RNA试剂盒,这款试剂盒通用性极强,几乎可以提取任何植物样本,受到了很多植物研究人员的喜爱。但是世上万物没有十全十美的,今天我们用实验自爆这款明星产品的缺陷。

实验目的:

验证Simgen高多糖多酚植物总RNA试剂盒存在的产品缺陷。

实验材料:

埃克莱尔(一种绿色月季花,由浙江农林大学友情提供)、研钵、液氮

高多糖多酚植物总RNA试剂盒(Simgen Cat.No.5103050

超微量电子天平(DENVER INSTRUMENTTP-213

旋涡震荡器(越新仪器,XH-C

超微量分光光度计(Simgen Cat.No.sim100

电泳仪(北京六一仪器厂,DYY-6C型) 

实验方法:

1 a. 称取250 mg花瓣放入研钵中,加入液氮研磨成粉末状。加入3 ml已加入β-巯基乙醇的Buffer RCT继续研磨直至呈匀浆状,分别吸取650 μl匀浆液(按50 mg组织换算成50 μl匀浆物+600 μl裂解液计算)到4RNase-free1.5 ml离心管中,编号1234,分别向12两管中加入1 μl RNase A

 b. 称取600 mg花瓣放入研钵中,加入液氮研磨成粉末状。加入1.8 ml已加入β-巯基乙醇的Buffer RCT继续研磨直至呈匀浆状,分别吸取800 μl匀浆液(按200 mg组织换算成200 μl匀浆物+600 μl裂解液计算)到2RNase-free1.5 ml离心管中,编号56

2. 600 μl Buffer EX,用力混合均匀后离心5 min

3. 吸取350 μl上清于洁净的1.5 ml管中,加入350 μl Buffer K混合均匀,混合液全部转移到过滤柱中离心;

4. 弃过滤柱,向滤液中加入700 μl 70%乙醇混合均匀,将混合液分两次加入核酸纯化柱中,离心弃滤液;

5. 依次加入500 μl Buffer WA600 μl Buffer WBR洗涤;

6. 14000 rpm空离1 min去除残留乙醇;

7. 将核酸纯化柱置于洁净的RNase-free1.5 ml离心管中,在纯化柱的膜中央加入50 μl RNase-Free Water,室温静置1 min,离心洗脱得到RNA 

实验结果:

1、在超微量分光光度计上用试剂盒的RNase-Free Water调零,测量洗脱下来的RNA,结果如下:

 

1250 mg加了RNase A的花瓣组织提取的RNA

3450 mg花瓣组织提取的RNA

56200 mg花瓣组织提取的RNA

2、1%的琼脂糖凝胶上,加入5 μl洗脱的RNA进行电泳,结果如下:


分析与讨论:
 

1. 从样品编号34测得的浓度可以发现,50 mg埃克莱尔花瓣就提取到了大约17 μgRNA,说明这种花瓣的RNA含量非常高。而同样是50 mg的花瓣,加入了1 μl RNase A12测得的浓度只有个位数,相当于没有,这应该是RNA都被降解掉了。

2. 当样本量增加到200 mg时,可以发现只提取到了大约33.5 μgRNA,只增加了大约2倍的量,并没有按照体积的增量相应地增加4倍。

3. 从电泳图可以看到,50 mg花瓣提取的RNA条带清晰完整,加了RNase ARNA确实都降解了,完全没有看到条带。200 mg花瓣提取的RNA则存在明显的降解情况。 

综上所述,证明了Simgen高多糖多酚植物总RNA试剂盒对有RNase A使用的环境常敏感,究其原因是裂解液Buffer RCTTrizol试剂一样含硫氰酸胍,不能Trizol试剂一样有效地变性灭活RNase A

其次在没有RNase A污染的正常提取过程中,Buffer RCT采用的策略是在RNA分子周围形成保护层,防止其被剪切断裂。但如果样本中的RNA含量太高,Buffer RCT就不能保证在所有的RNA分子周围形成有效的保护层,导致最后提取到的RNA出现部分降解的情况。

最后我们提醒用户使用Simgen高多糖多酚植物总RNA试剂盒必须注意以下两点:

1. Simgen高多糖多酚植物总RNA试剂盒对RNA酶污染非常敏感,千万不要在使用RNA酶(比如提取质粒DNA)的实验室提取RNA,包括用过RNA酶的移液器也不能用作提取RNA

2. 精确控制样本用量,切忌太随意。使用Simgen高多糖多酚植物总RNA试剂盒时,宁愿少用样本,也不要多用样本。对于嫩叶嫩芽等RNA含量高的样本用量应控制在100 mg以内,只有RNA含量低的样本(比如土豆,水果等)才推荐用到200 mg的组织,否则提取的RNA可能会出现降解现象。