物种源性鉴定中的假假真真

作者:新景实验室
版权说明:本文系原创文章 转载请标注出处和本文链接

前段时间为了扩展物种源性鉴定试剂盒的种类,决定增加马源和驴源的鉴定试剂盒。在研发阶段遇到了一些意想不到的事情,今天小新来和大家分享一下。

一、查阅资料

物种源性鉴定试剂盒采用TaqMan实时荧光PCR技术,根据各物种间基因序列差异而进行动物源性成分鉴定。本次马和驴的特异性引物及探针是采用了《SB/T 10923-2012 肉及肉制品中猪、牛、羊、马、驴、鸡、鸭、鹅、兔源性成分的快速鉴定 实时PCR法》,具体序列如下:

马源性成分检测用引物(对)序列为:

FP:5′- CCAATGCGTATTCTGACTCTTAGTG -3′

RP:5′- CGATAATTACGTATGGGTGTTCC -3′

Pro:5′ FAM- CTGACACTAACATGAATCGGCGGACAGC-TAMRA 3′

驴源性分检测用引物(对)序列为:

FP:5′- CCTCAGCACTCCCCCTCAT -3′

RP:5′- AAGGATAAGGGCTAATACACCA -3′

Pro:5′ FAM- CCAGAATGGTATTTCCTATTTGCTTACGCC-TAMRA3

二、提取马、驴DNA

引物和探针搞定后,接下来就是DNA了,为此小新专门在淘宝上购买了一份马肉和一份驴肉,然后用Simgen动物组织DNA试剂盒(Cat.No.3101050)分别提取马肉和驴肉的DNA。

三、PCR扩增

最后就是PCR扩增测试了,在配置扩增试剂的时候,小新突然想到网上说的驴肉频繁造假事情,再加上买的驴肉居然比马肉还便宜,心里有些不踏实,于是决定验证一番。扩增曲线如下:


1-4是用的马特异性引物探针,1是阴性对照,23是提取的马肉DNA4是提取的驴肉DNA

5-8是用的驴特异性引物探针,5是阴性对照,67是提取的驴肉DNA8是提取的马肉DNA

购买的马肉看来是真的,扩增结果无异常。但是驴肉确实是假的,这个所谓的驴肉不能用驴的特异性引物探针扩增出来,但可以用马的特异性引物探针扩增出来,只能说明这是马肉造假的驴肉。

四、新一轮探索

于是小新又换了一家淘宝店购买驴肉,并和店家沟通了一番。在了解到小新是为了做物种检测后,商家大方的送了一根带点肉的驴骨做检测用。用骨头上带着的驴肉提取了DNA并进行了PCR扩增,结果如下:


1-4是用的马特异性引物探针,1是阴性对照,23是提取的马肉DNA4提取的驴肉DNA

5-7是用的驴特异性引物探针,5是阴性对照,67提取的驴肉DNA

结果显示新提取的驴肉DNA不仅能用驴的特异性引物探针扩增出来,同时也可以用马的特异性引物探针扩增出来,不过扩增效率要差一些。

小新与小伙伴们对于这一结果经过多番探讨,觉得有两种可能:

1.怀疑驴肉上沾染到了马的DNA。于是敲开驴骨,提取了3管骨髓的DNA进行PCR。扩增结果如下:


1-4是用的马特异性引物探针,1是阴性对照,2是提取的马肉DNA34是提取的驴骨髓DNA

5-8是用的驴特异性引物探针,5是阴性对照,67、8是提取的驴骨髓DNA

结果显示驴骨髓DNA仍旧能用马的引物探针扩增出来,这说明不是样本的问题

2.怀疑马的引物有问题。于是专门去NCBI上Blast,发现确实有点问题,用马的引物进行Primer-BLAST时,查找生物选择驴(Equus asinus),最后居然也找到了对应的序列,当然其中有个别碱基不同,这应该就是为什么扩增效率低的原因吧。

之后小新又重新合成了一组新的引物探针,这次采用的是《SNT 3730.5-2013 食品及饲料中常见畜类品种的鉴定方法 第5部分:马成分检测 实时荧光PCR法》中的引物探针序列,并且上NCBI又核对了一遍,确认没有问题。最后扩增结果如下:


结果证实确实是引物探针存在问题

五、总结与分析

1. 马和驴都是属于脊索动物门、脊椎动物亚门、哺乳纲、奇蹄目、马科、马属,只有种不一样,亲缘关系比较近,导致两者间的基因有很多相同或者类似的,因此设计引物时需要多加注意。

我们的实验证明了《SNT 3730.5-2013 食品及饲料中常见畜类品种的鉴定方法 第5部分:马成分检测 实时荧光PCR法》中设计的马引物探针序列比较靠谱,《SB/T 10923-2012 肉及肉制品中猪、牛、羊、马、驴、鸡、鸭、鹅、兔源性成分的快速鉴定 实时PCR法》中的马引物探针设计有缺陷,建议不要采用。

2. 造假情况比我们想象的还要接近我们的生活,就像这次买的“驴肉”,当时还是挑选的一家销量不错的店,没想到还是被骗了。由于卖家对我们这种专业做物种源性检测的用户还拒不认错,我们决定曝光一下这家淘宝天猫店——味健旺旗舰店,提醒大家不要上当受骗。

3. 这次实验可谓是一波三折,不仅买的样品出现造假情况,就连非常严肃的参考资料都有漏洞。这就提醒我们不能盲目相信网上的各种信息,科学地设计实验,细心地验证,才是最有保障的获取知识的方法

备注:实验所采用的一些仪器、设备、试剂如下

试剂:

动物组织DNA试剂盒(Simgen,Cat.No.3101050)

2×Probe qPCR Mix(Simgen,Cat.No.7206100)

仪器:

超微量电子天平(DENVER INSTRUMENT,TP-213)

旋涡震荡器(越新仪器,XH-C)

台式离心机(eppendorf Centrifuge 5415 D)

超微量分光光度计(Simgen Cat.No.sim100)

荧光定量PCR仪(ABI7500)