如何从-80℃冻存的抗凝全血中提取RNA(技术文章)

作者:新景实验室
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我们先来看网络上的一个求助帖:

已经积攒了一批抗凝血由于当时未多加考虑,取标本后就直接放在-80度了请问:
这样对提取RNA影响大吗我该怎样防止血液融化时RNA被酶解呢具体该怎样操作呢
谢谢我是新手请多帮助!!!!
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冻存的时间过长,即使温度很低,RNA也可能降解。
你的这种情况,在融解之前在冻块上面加入RNA酶抑制剂溶液后再融解,融解过程中注意抑制剂溶液及时与融化血液混合,不要剧烈振荡。只要RNA在冻存过程没有降解,这样就不会有太大问题。
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这样不可避免RNA的降解。
我们也遇到这样的问题,我们的首席教授告诉我们应该在冻存时直接加入TRIZOL。这样可以避免RNA被降解
回复
非常感谢只有提提试一下了
RNA酶抑制剂溶液是指的什么1 ml血液加多少有要求吗

从上面的求助帖中我们可以总结出几大信息:

1. 血液直接冻存到-80℃再提取是个大问题,没有人能确切回复可行的操作方案。实际上即使我们查找著名的核酸纯化试剂盒公司QIAGEN的网站,也找不到从-80℃冻存的血液中提取RNA的方法。

2. 血液不加任何试剂直接冻存在-80℃时,RNA会降解吗?如果会降解,多久会降解完?

回复的建议都是猜测性的,没有做过实际的测试。

众所周知,RNA容易降解,所以一般提取RNA都会使用新鲜的样本,如果新鲜样本不能立即提取RNA,应立即放到-80℃冻存从这一点上讲,发帖的求助者也没做错。但关键是血液中的红细胞不含有RNA,提供RNA的主要是白细胞,市面上主要的血液RNA提取试剂盒(比如QIAGEN)用到的原理是将白细胞与其它组分分离(用红细胞裂解液去除红细胞)再提取其中的RNA。一旦血液经过冷冻就会出现溶血现象,这时所有的细胞都发生破裂,已经无法分离白细胞了,使用这种方法自然也就提不到RNA

Simgen独创的全血总RNA试剂盒,是无需红细胞裂解液分离白细胞,直接从全血中提取RNA的,是不是能从冷冻的抗凝血中提取到RNA呢?让我们实测一下吧:

实验材料:-80℃冷冻75天的抗凝全血;预先按500 μl血样比1 ml Buffer L9的比例加入Buffer L9的同一个抗凝全血样本作为对照组(备注:Simgen 全血总RNA试剂盒中的Buffer L9与抗凝全血预混后可在-20℃长期冻存,RNA不会降解)。

实验试剂:全血总RNA试剂盒(simgenCat.No.5201050)、

cDNA第一链合成试剂盒(simgenCat.No.7306025)、

2×SYBR Green PCR MixsimgenCat.No.7106100)、

β-actin引物(Forward TGACGTGGACATCCGCAAAG

/Reverse:  CTGGAAGGTGGACAGCGAGG

实验方法:

1. 分两组进行对比实验,每组各做两管:第一组22 ml离心管,加入500 μl新鲜全血,编号12;第二组加入500 μl新鲜全血后再加入1 ml Buffer L9,混合均匀,编号34。将两组样本置于-80℃冻存,冻存75

2. 75天后取出后置于室温,待血样全部融化后,12中加入1 ml Buffer L9混合均匀

3. 13000 rpm离心10分钟

4. 吸取700 μl离心上清转移到装有500 μl无水乙醇的1.5 ml 离心管中,混匀

5. 分两次将混合液转移到核酸纯化柱中,离心去滤液

6. 依次用500 μl Buffer WA700 μl Buffer WBR洗涤一次;

7. 50 μl RNase-Free Water洗脱RNA

8. 在微量紫外分光光度计上测量RNA的浓度;

9. 琼脂糖凝胶电泳;

10. 逆转录制备cDNA

11. 5 μl cDNA模板进行RT-PCR检测。

实验结果:

1.在微量紫外分光光度计上用RNase-Free Water调零,测量洗脱下来的RNA结果如下,


表一的数据上可以看出两种方处理的抗凝血经过75天的长期保存后均提取出了RNA,且浓度并无太大差异

2.1%的琼脂糖凝胶上,加入8 μlRNA,电泳15 min,结果如下,


从图一所示的电泳图中可以看出,四个样本的电泳条带都很清晰。

 3.荧光定量PCRβ-actin基因检测结果,


从图可以看出,两组不同处理的冷冻全血中提取的RNA经逆转录后获取的cDNART-PCR检测中几乎与阳性同时起线,且Ct值较靠前

从本次实验可以得出结论:由于Simgen全血总RNA试剂盒可以从血液中直接分离纯化总RNA,不需事先分离白细胞,自然也不怕冷冻血液溶血。本次实验测试,一次可以从500 μl -80℃贮存75天的冷冻全血中提取到3 μg左右的血液总RNA,且纯度很高,完全满足后续基因检测的需要。

最后我们可以对网络上的求助帖做几条有价值的回复了:

1. -80℃冻存的抗凝全血,如果用Simgen全血总RNA纯化试剂盒提取RNA则结果影响不大。

2. 抗凝全血在-80℃冻存时间小于75天的,提取到的RNA尚未观察到有严重的降解。

3. 解冻后的抗凝全血立即用Simgen全血总RNA纯化试剂盒提取RNA,即使不加RNA酶抑制剂,RNA也不会被降解。

对具体操作感兴趣的同学,也可以点击观看视频:https://v.qq.com/x/page/g0323yn2iz8.html



操作视频



Simgen实验室

2017.12.02