核酸纯化柱的稳定性测试方法

作者:新景实验室
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前段时间有家做过滤器材的公司(后文简称A公司)找到我们,说是可以给我们提供核酸纯化柱。虽然Simgen的核酸纯化柱都是自产的,但是出于好奇,我们还是要了一些试用装,测试它的核酸吸附效率以及稳定性。现在我们把测试方法分享给大家,作为核酸纯化柱选择的一个依据。

 

(一)实验目的

对比测试Simgen核酸纯化柱和A公司核酸纯化柱的性能。


(二)实验材料与设备:

1. 新鲜培养的质粒菌

2. 快速质粒DNA小量试剂盒(Simgen Cat.No.1005050A公司提供的质粒DNA纯化柱

3. 台式离心机(eppendorf Centrifuge 5415 D

4. 旋涡振荡器(越新仪器,XH-C

5. 超微量分光光度计(Simgen Cat.No.Sim-100

6. 电泳仪(北京六一仪器厂,DYY-6C型 )

7. 电热恒温培养箱(上海精宏实验设备有限公司,DNP-9082

 

(三)实验内容:

1. 12000 rpm离心30秒收集53 ml过夜培养的细菌,弃尽培养基。加入250 μl已加入RNase A Buffer I,充分悬浮沉淀的细菌。

2. 加入250 μl Buffer II,温和并充分地翻转离心管4-6次。

3. 加入350 μl Buffer N8,温和并充分地翻转离心管直至溶液中残留的蓝色沉淀全部消失,转变为淡黄色沉淀。

4. 13200 rpm离心2分钟。

5. 将所有上清液倒入50 ml离心管中,混合均匀,各取2Simgen公司和A公司的核酸纯化柱置于2 ml离心管中,吸取800 μl混匀的上清液加入到各个核酸纯化柱中,盖上管盖,12000 rpm离心30秒。

6. 2 ml离心管中的滤液,将核酸纯化柱置回到2 ml离心管中,在核酸纯化柱中加入800 μl Buffer W2,盖上管盖,12000 rpm离心30秒。

7. 2 ml离心管中的滤液,将核酸纯化柱置回到2 ml离心管中,最高速13200 rpm离心1分钟。

8. 2 ml离心管,将核酸纯化柱置于一个洁净的1.5 ml离心管中,在纯化柱的膜中央加入60 μl Buffer E,盖上管盖,室温静置1分钟,12000 rpm离心30秒。

9. 在超微量分光光度计上测量洗脱的质粒DNA的浓度并进行琼脂糖凝胶电泳检测。

10. 各取10Simgen公司和A公司的核酸纯化柱,在50℃恒温箱中放置7天,7天后各取出2个核酸纯化柱,再加上2Simgen公司同一批的未放入恒温箱的纯化柱,按步骤1-9再测试一遍。

 

(四)实验结果:

1. 在超微量分光光度计上用Buffer E调零,测量洗脱的质粒DNA,结果如下:

样本编号0为常温放置7天的Simgen核酸纯化柱,样本编号150℃放置7天的Simgen核酸纯化柱,样本编号250℃放置7天的A公司核酸纯化柱。 


2. 1%的琼脂糖凝胶上,加入5 μl提取到的质粒DNA,电泳20
分钟,结果如下:



(五)实验讨论与分析:

1. 结合表1和图1分析可知,未经恒温箱放置前,两公司的核酸纯化柱对质粒DNA的吸附效率无明显差异。

2. 结合表2和图2分析可知,Simgen核酸纯化柱在50℃放置7天后核酸吸附效未受影响,与室温放置的对照组吸附效率无明显差异,而A公司的核酸纯化柱在50℃放置7天后核酸吸附效果明显变差,吸附效率只有原来的30%

3. 作为柱式核酸纯化试剂盒中的核酸纯化柱,其重要性往往被忽略甚至是国际巨头Qiagen公司也栽过跟头,曾经要求用户将柱子放到2~8℃储存,以免影响其回收效率。所以测试纯化柱稳定性的方法也很简单,只要将纯化柱在高于常温的条件下放置一段时间,就能辨别出柱子的稳定性差异。国内的T**ngenO**ga等厂家的一些试剂盒要求用户在使用前用平衡液洗涤纯化柱,其本质就是纯化柱稳定性有缺陷所导致的。所以用户在大量选购纯化柱时务必要做一下纯化柱的稳定性测试,如果不巧是选用了来源不明的核酸纯化柱(特别是没有核酸纯化技术累积的公司),为了保险起见,最好是放到2~8℃储存。